背景
造血干细胞(HSCs)是可以产生多种造血细胞，进而产生血细胞的干细胞。在适当条件下，具有分化为各系造血细胞的能力，并具有长期处于非增殖状态的特性。造血干细胞的增殖是扩大造血干细胞数量的过程，增殖得到的造血干细胞还可以进行分化，进而逐步放大造血细胞数量。人体在骨髓中生产和存储造血干细胞，称为骨髓造血干细胞，还有一部分在外周血液、脐带及胎盘中[1]。
造血干细胞的培养
由于造血干细胞主要来源于骨髓、外周血、脐带或胎盘，根据不同来源主要分为四种不同的分离培养方法。
1、骨髓造血干细胞的分离与培养
造血干细胞的经典来源是骨髓。骨髓中造血干细胞的含量约为1%-3%；其他成分为基质细胞、基质干细胞、祖细胞、成熟和正在成熟的白细胞和红细胞[2]。
材料
① 组织来源：健康骨髓。
② 培养试剂：1％白蛋白盐水液。
③ 培养基配方：IMDM培养液。
④ 实验器材：培养皿、50mL和15mL离心管。
方法
1）取材
抽取骨髓液5mL，按4:1比例加入6%羟乙基淀粉(HES)，自然沉降红细胞后，分离上层液体。
2）分离
细胞在4℃下，以1500r/min离心10分钟，将细胞沉淀物用1％白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
3）接种与培养
将细胞以3 x 106/ml密度接种于培养瓶中，加入IMDM培养基于37℃， 5%CO2孵箱中培养，每3天换液。
结果
骨髓来源的造血干细胞悬浮于培养液中，胞体圆形，培养3-4天，细胞集落形成，培养21天左右，细胞生长达到顶峰，随后细胞生长速度减慢。
注意事项
1） 抽取骨髓时要避免混进血液。
2） 骨髓供者状态直接影响造血干细胞的分离。
2、外周血干细胞的分离与培养
从外周血收集细胞比从骨髓中收集更容易，外周血收集的细胞中干细胞的含量比从骨髓中收集的高1倍。因此，外周血干细胞(PBSC)，已在很大程度上代替骨髓，成为自体移植的最主要干细胞来源。在正常生理条件下，外周血的造血干细胞量极少，但对供体注射一种细胞因子，如粒细胞刺激因子(G-CSF)，可加速骨髓造血干细胞的生成并释放到外周血中。一般在收集细胞前几天对供体注射G-CSF。收集时在静脉中插入导管，使血液通过分选系统，选出CD34+白细胞，让红细胞返回供体。在选出的细胞中大约有5%-20％是HSCs。骨髓中CD34+细胞是干细胞、祖细胞和各个成熟阶段白细胞的混合物[3]。
材料
① 组织来源：健康静脉血。
② 培养用试剂：1％白蛋白盐水液。
③ 培养基配方：IMDM培养液。
④ 实验器材：培养皿、50mL和15mL离心管、血细胞分离机。
方法
1） 取材
经G-CSF动员的外周血，血细胞分离机离心使细胞分层。
2） 接种细胞
采集单核细胞，将采集分离的单个核细胞按2 x 106/ml密度接种至培养瓶内，加入培养基，37℃ ，5%CO2条件下培养。
结果
倒置显微镜观察，分离的细胞悬浮生长，大小不一，培养3-4天，可见细胞集落形成。
注意事项
动员后的外周血可以提取干细胞培养，但细胞量少，常要使用集落刺激因子、生长因子等体外扩增造血干细胞。
3、脐带血干细胞
与骨髓和动员的外周血收集造血干细胞相比，脐带血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞，且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞具有较低的免疫排斥活性，脐带血是造血干细胞的重要来源[4]。
材料
① 组织来源：脐带血
② 培养用试剂
– PBS
– 血液保存液
③ 培养基：IMDM培养基，含20％的胎牛血清、50ng/mL人重组蛋白、20ng/mL干细胞因子(SCF)，20ng/mL白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-3(IL-3),20ng/mL G-CSF，20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
④ 实验器材：培养皿，注射器。
方法
1） 取材
无菌采集脐带血置于血液保存液中，6-8小时内进行分离。
2） 分离
细胞新鲜脐血按4:1体积比加入60g/L的羟乙基淀粉，静置40-60分钟，去除沉淀的红细胞，收集血浆，PBS洗涤2次，Ficoll离心分离出单个核细胞。
3） 接种与培养
用IMDM培养液洗涤两次，以2x105/mL浓度接种于培养板，于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。
结果
培养2-3天，可见细胞集落形成，培养14天，集落细胞增殖达到顶峰，随后细胞生长速度减慢。
注意事项
收集到的脐血在6小时内进入分选程序。
4、胎盘造血干细胞
胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的8-10倍，可提供给多个患者治疗。胎盘造血干细胞移植能有效解决骨髓或动员后外周血来源不足等难题[5]。
胎盘来源造血干细胞体外培养开成红系集落图[5]
材料
① 组织来源：胎盘
② 培养用试剂
– Hanks溶液
– 0.25％胶原酶
③ 培养基：RPM1640培养基，荧光标记单克隆抗体CD38-FITC，CD34-PE。
④ 实验器材：眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、培养皿、过滤器、注射器。
方法
1） 取材
多点剪取胎盘组织，Hanks溶液漂洗3次，将其充分剪碎。
2） 消化
0.25％胶原酶消化20分钟，用过滤器过滤，细胞滤液1000r/min离心5分钟。
3） 分离
细胞沉淀用100mL的RPMI1640混匀。胎盘单细胞悬液按4:1的比例加入6%羟乙基淀粉(6% HES)，混匀，静置45分钟至红细胞完全沉降。吸取富含单核细胞的上层液，按1:3的比例加入Hanks液，1000r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物用含15%胎牛血清的RPMI1640培养基悬浮，再按1:3的比例加入红细胞裂解液，作用5分钟。1000r/min离心5分钟，细胞沉淀物用含15% 胎牛血清的RPMI1640洗涤、悬浮，过滤。
4） 接种
细胞以2x106/mL浓度接种于培养板，于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。
结果
分离的细胞悬浮生长，培养2-3天，可见大小不等的细胞集落形成，培养14天，可见集落内有80-100个细胞。
注意事项
1） 收集到的胎盘在6小时内必须进入分选程序。
2） 从胎盘组织可以获得高丰度、高富集度、高活性的造血干细胞。
上述内容简要概括了不同组织中分离造血干细胞的基本方法，因为造血干细胞存在于骨髓，外周血等长期保存较为困难的组织中，所以对于要用于分离造血干细胞的组织，需尽快进行细胞分离，防止因其他原因造成的样本变质或损坏。以上方法仅可以用作样本组织中造血干细胞的分离，不能确定获得的细胞即为造血干细胞，后续还需进行流式分选，确定造血干细胞的纯度以及排除细胞的交叉污染，且在完整的实验过程中需要保持操作环境以及实验步骤的无菌控制。
参考文献
[1] 吴祖泽.造血干细胞研究进展[J].生理科学进展,1979(02):142-152.
[2] 郝蕾,伍柏松,谭渭泉等.骨髓造血干细胞羟乙基淀粉分离方法的探讨[J].第四军医大学学报,1989(06):418-420.
[3] 刘力民,严文伟.外周血造血干细胞移植的临床应用[J].国外医学.输血及血液学分册,1988(02):99-102.
[4] 陈林,张坤,邵文陶等.脐带血造血干细胞分离冻存方法优化[J].重庆理工大学学报(自然科学),2014,28(12):82-86.
[5] 黄海军. 胎盘造血干细胞库构建的初步研究[D].华南理工大学,2019.
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