耳类器官构建
2023年Stephen T Moore等人成功通过人类诱导多能干细胞建立了高保真性耳蜗类器官。并探寻了耳类器官培养的必要条件，同时建立了用于形成耳类器官的培养体系[1]。本文将对其阐述的耳类器官培养方法与过程进行简单介绍。
耳类器官荧光染色图[1]
耳类器官分化培养方法
1. 多能干细胞培养基中添加新霉素，用于抵抗支原体感染。
2. 向配置好的培养基中加入Y-27632，调整浓度为20 μM。
3. 向低吸附96孔U型板中每孔加入100 μL配置完成的培养基。
4. 使用细胞消化液消化hESCs，并以3500细胞每孔的密度接种于准备好的培养板中。
5. 120 g离心5分钟离心后孵育4 h
6. 向每孔加入100 μL配制完成的培养基。继续孵育48 h后开始诱导非神经上皮分化。
7. 使用移液管将培养后的聚集体转移至10 cm的培养皿中，轻轻旋转培养皿使聚集体向培养皿中心聚集，使用移液管将聚集体转移至2 mL的离心管中。
8. 配制分化培养基：多能干细胞培养基添加新霉素、4 ng/mL的FGF-2、10 mM的SB-431542、2%生长因子减量基质胶、1-2 ng/mL BMP4。
9. 使用HEPES缓冲液洗涤3次以去除聚集体内旧的培养基，使用新配置的培养基重新洗涤3次。
10. 将清洗后的聚集体转移至含有100 μL分化培养基的96孔U型板中，培养3天。
11. 分化第三天，向每孔加入25 μL含有250 ng/mL的FGF-2、200 nM LDN-193189的基础培养基。
12. 分化第7天，将聚集体转移至10 cm培养皿中，轻轻旋转培养皿使聚集体聚集在中央。
13. 使用移液管将聚集体转移至2 mL离心管中
14. 配制培养基：基础分化培养基含有3 mM CHIR 99021、200 nM LDN和50 ng/mL FGF-2。
15. 使用基础分化培养基和HEPES洗涤聚集体3次，用配制完成的培养基继续洗涤聚集体3次，
16. 将聚集体转移至100 μL培养基的96孔U型培养板内继续培养。
17. 分化第11天，将聚集体转移至10 cm培养皿中，轻轻旋转培养皿使聚集体聚集在中央。
18. 使用移液管将聚集体转移至2 mL离心管中
19. 配制类器官成熟培养基(OMM)：由1:1的高级DMEM:F12和神经基础培养基的混合物组成，其中添加N2补充剂，去除维生素A的B27, GlutaMAX，β-巯基乙醇和去甲霉素。
20. 配制培养基：OMM中含有1%的GFR和3 mM的CHIR9901。
21. 使用基础培养基和HEPES洗涤聚集体3次，用配制完成的培养基继续洗涤聚集体3次。
22. 将聚集体转移至含有配制完成培养基的6孔培养板中继续培养。
23. 在第13天向OMM中加入3 mM CHIR99021，继续培养。
24. 培养第18天，清洗收集类器官，并将收集的类器官转移至含有OMM中，使用OMM继续培养
25. 在后续的培养中使用新鲜OMM进行每周两次的培养基更换。
先前的内耳类器官方案只产生具有与前庭毛细胞相似的结构、分子和生理特性的毛细胞。而Stephen T Moore等人的研究开发了一种在类器官中获得耳蜗毛细胞类型的方法。为研究内耳类器官提供了重要依据和思路。
参考文献
[1] Moore ST, Nakamura T, et al. Generating high-fidelity cochlear organoids from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2023 Jul 6;30(7):950-961.e7. doi: 10.1016/j.stem.2023.06.006.
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