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肿瘤类器官生物库的构建

一米生物

2025-06-10

肿瘤类器官

生物库的构建

肿瘤类器官根据来源主要分为两类，一类为来源于患者原位肿瘤组织经过体外培养后得到的肿瘤类器官，另一类为来源于正常组织类器官通过基因编辑等方法诱导形成的肿瘤类器官；后者即利用基因编辑技术操作关键基因从而加速细胞癌变，使得类器官的微观特征接近于恶性肿瘤^[1]。本章节提及的PDO 是来源于患者肿瘤组织的干细胞在体外自组装形成的3D细胞结构，能够较好地保留原位肿瘤的基因组改变、分子病理学特征和对放化疗的敏感性。本章主要介绍使用原发肿瘤病灶、转移灶等患者来源组织构建PDO的经典方法^[2]，具体步骤如下(图1)。

图1 肿瘤类器官模型常规构建及药物筛选流程^[3]

药物筛选

肿瘤组织的收集和处理

从手术或活检标本中尽量选取富含血管和上皮细胞的部位，剔除坏死组织、脂肪以及肌肉组织。在运送到实验室的过程中需将组织块储存在保存液中，并置于冰上运输。在肿瘤样本足够大时，可将部分肿瘤标本放置于4%的多聚甲醛溶液中用于后续石蜡块的制作；将部分肿瘤标本储存于液氮中，用于后续相关测序或者分子生物学实验。构建肿瘤类器官亦可以使用冷冻保存的组织，但构建效率低于使用新鲜组织。

肿瘤类器官的构建

利用肿瘤组织构建类器官通常包括以下几个步骤:

①使用手术刀切碎组织块；

②用胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、酶混合物等将切碎的肿瘤组织块消化成单细胞悬液或细胞团，注意在消化过程中定期检查肿瘤组织块消化程度；

③将消化后的细胞团用含青/链霉素的预冷 PBS反复清洗，后离心去上清，将细胞沉淀用基质胶重悬；

④加入合适培养基，在 37℃和5%CO，的细胞培养箱中培养。在构建不同癌种的PDO的过程中，使用的酶的类型及其浓度、消化时间、细胞团大小、基质胶、种板密度和培养基等方面均存在差异。

利用循环肿瘤细胞(circulating tumor cells， CTCs)构建PDO首先需要从患者血液中富集CTCs，较为常用的富集方法是阴性富集法(免疫磁性分离)和过滤法^[4]。阴性富集法是指利用CD45磁珠抗体偶联的磁珠吸附去除CD45+的白细胞，间接筛选出全部类型的CTCS。过滤法则利用CTCs的物理特性，即细胞大小，将患者外周血加入过滤器中，离心收集CTCS。将富集的CTCs加入基质胶内并种板，后续处理方式与肿瘤组织来源的类器官基本相同^[5]。

不同肿类器官所需的诱导因子不尽相同，其中多包含酪氨酸受体激酶的配体、Wnt信号通路激活剂、TGF-β信号通路抑制剂等。每2~3天更换一次培养基，以确保培养基中有足够的因子。在种板后的前几天应密切监测类器官的状态，以防止潜在的细菌或真菌感染。此外，还应定期检查类器官是否有支原体污染。

肿瘤类器官的分离和传代

预先在显微镜中观察类器官的状态(包括类器官的大小、折光度和基质胶背景等)是否符合传代条件，建议在类器官状态良好时进行传代。若分离类器官时使用酶解液进行消化，应密切监测消化进程，以免过度消化。当观察到由3~5个细胞组成的小细胞团和单细胞混合时，停止消化。处理囊状或葡萄状类器官时，可以使用机械吹打的方式将类器官从基质胶中分离。将分离后的类器官重新吹打至合适大小后重新种板，传代后前2~3天可向培养基中加入10μM Y-27632，确保类器官的正常生长。

肿瘤组织的收集和处理

当类器官增殖状态良好时进行冻存有利于提高复苏成功率。冻存前将类器官与基质胶分离，收集传代类器官至合适大小的类器官碎片，加入冻液并置于-80℃冰箱中，过夜后转移至装有液氮的液氨罐中长期保存。复苏时将冻存管迅速转移至37℃水浴锅中融化，然后转移至复苏液中，离心后重新种板，用含有Y-27632的新鲜培养基培养。冻存或复苏可能会导致类器官形态的变化，并可能影响药物筛选^[6]。

其他构建方法

除上述经典的肿瘤类器官构建方法外，近年来研究者们开发出了新的具有独特优势的构建技术。气液交互法(air-liquid interface, ALI)将含有基质细胞、免疫细胞的肿瘤组织经过剪切后，重悬于基质胶中，在transwell 上室中进行培养。胶顶部暴露在空气中，transwell 的下室中加入培养基，可通过 transwell 上室底部的膜扩散到上室中，形成气液交互界面。这种利用气液交互法培养的类器官成功保留了原肿瘤组织中的纤维基质和免疫细胞，可重现肿瘤免疫微环境^[7]。

沈西凌团队首次利用带有温度控制的液滴乳化微流控技术建立了微小类器官球体模型(MOSs)^[8]。其原理是将肿瘤患者来源的少量原代组织制备成单细胞悬液，加入基质胶中，然后与双相液体(油)混合，生成大量MOSs，每个MOS含有约30个肿瘤细胞。将生成的 MOSs 聚合凝固后反乳化去除多余油脂后即可进行快速悬浮培养。此构建方法可在原代肿瘤组织量少的情况下实现两周内的快速药敏检测，并且 MOSs中存在部分免疫细胞和成纤维细胞，可用于评估免疫治疗的疗效和探究成纤维细胞相关治疗靶点的疗效^[3]。

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参考文献

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1.Artegiani B, Hendriks D, Beumer J, et al, Fast and efficient generation of knock-in human

organoids using homology-independent CRISPR - Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol.

2020，22(3):321-331.

2.Driehuis E, Kretzschmar K, Clevers H, Establishment of patient-derived cancer organoids for

drug-screening applications,Nat Protoc,2020,15(10):3380-3409.

3.陈晔光.类器官及其应用[M].上海科学技术出版社，2023.

4.Zhang L, Mo S, Hu X, et al, Establishment and identification of organoids from human

circulating colorectal cancer cells, Clin Transl Med, 2020,10(8): e247.

5.De Angelis M L, Francescangeli F, Nicolazzo C, et al, An organoid model of colorectal circulating

tumor cells with stem cell features, hybrid EMT state and distinctive therapy response profile. j

Exp Clin Cancer Res,2022,41(1):86.

6.Kim M, Mun H, Sung C O, et al, Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models

for therapeutic screening.Nat Commun, 2019,10(1): 3991.

7.Neal J T, Li X, Zhu J, et al, Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell.

2018，175(7):1972-1988.

8.Ding S, Hsu C, Wang Z, et al., Patient-derived microorganospheres enable clinical precision

oncology.Cell Stem Cell，2022，29(6):905-917.

公司简介

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