什么是免疫组化？
免疫组化（IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再使一抗与标记生物素、荧光素等的二抗（或与二抗相连的一抗后抗体）相结合，二抗与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）等酶标记，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分。在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞涂片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
免疫组织化学技术原理示意图
免疫组化常用的标本类型
免疫组织化学技术可用于检测石蜡切片、冰冻切片及细胞涂片。大部分抗体可用于石蜡切片，且适用于石蜡切片的抗体往往也适用于冰冻切片和细胞涂片。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织抗原，但是缺点也很明显组织形态结构较差，定位不是很清晰。石蜡切片的优点是组织形态结构好，定位清晰，但是在样品的处理过程中容易破坏组织抗原。
免疫组织化学流程
免疫组化
实验流程及注意事项
1
固定
固定可保存组织细胞内的抗原成分和原有的形态结构，防止组织抗原弥散。多采用4%甲醛溶液浸泡组织，固定液用量大概是组织的10-20倍，标记的组织块不宜过大（大块组织应切为小块，防止固定不充分）。
固定良好的切面呈灰白色，质感较硬而具有弹性。
2
脱水
石蜡切片要求组织被熔化的石蜡浸透，而石蜡和水不相溶。脱水可以使组织内部的水分逐步被替换出来，有助于组织充分浸蜡。
脱水一般采用从低到高浓度乙醇脱水，组织经过70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，其中95%乙醇和100%乙醇经两缸试剂脱水。
3
透明
透明可将脱水剂乙醇从组织内用透明剂置换出来，以利于熔化的石蜡进入组织。
组织经脱水透明后，整块组织呈透明状，无白色浑浊的状态。常用的透明剂是二甲苯，在室温下组织透明时间以30-60 min为宜，不宜过长。依据组织的大小肉眼观察组织，适当调整透明时间。
4
浸蜡包埋
常用包埋剂为石蜡，在60-62℃电热恒温箱内保持熔化状态，将组织在其内浸透一定时间，一般组织为2-4小时，分2缸石蜡按顺序进行操作。
包埋时将包埋模具放在自动包埋机的出蜡嘴下方，注入熔化的石蜡，用镊子把组织轻轻按平，放在自动包埋机的冷冻台上凝固，凝固后脱去包埋模具。
5
切片烤片
按需求切片，厚度一般为4-5 μm，展片可先放在5%-10%的乙醇内然后转移到恒温（40-46℃）水中。
6
脱蜡和水化
脱蜡和水化可使后面的抗体等试剂能充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20 min，然后立即二甲苯1-3分别10 min（时间由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定），当天制好的切片一般先60℃ 3-4 h。
水化用梯度乙醇（100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，由高到低）。若脱蜡和水化不全，则易出现局灶性反应和浸洗不全，进而产生非特异性背景着色。
7
灭活内源性过氧化物酶
防止内源性过氧化物酶活性对实验结果造成的干扰，使用3% H₂O₂ 常温下避光孵育10 min，PBS冲洗3次,可以有效减少非特异性染色。
8
抗原修复
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。
通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（中性的、高pH的等）。
9
血清封闭
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。
封闭血清一般是和二抗同一来源的、血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。
也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30 min。但也要防止封闭过度。
10
一抗孵育
一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。
一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃。
孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃ 1-2 h，而4℃过夜和从冰箱拿出后需要37℃复温45 min，再用PBS冲洗。
11
二抗孵育
二抗一般室温或37℃ 30 min-1 h，而浓度一般有工作液。
抗体稀释液一般就用PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。最后用PBS冲洗。
12
SP反应
滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗。
13
DAB显色
配置DAB/H₂O₂反应液孵育组织切片，镜下控制染色，一般3-10 min，自来水充分冲洗。
背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。
DAB显色时间并不固定，由显微镜下控制时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。
14
苏木素复染
目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。经常用苏木素复染（胞核染料）。
苏木素复染时间需要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒到数分钟，胞浆蛋白则可以适当延长时间，而胞核蛋白则要缩短。若过染，可以用1% HCl褪色。
15
脱水透明
免疫组化梯度酒精脱水，以避免直接将组织投入高浓度酒精中而造成组织过度收缩。之后，二甲苯1-2次透明。
16
封片
为了长期保存采用中性树胶封片，避免产生气泡。
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