干细胞所处的环境即细胞外基质是促进干细胞自我更新和分化的关键。细胞外基质(extracellular matix,ECM)是由多种蛋白质和蛋白多糖组成的3D纤维网络。它不仅能够为细胞做结构支持，而且对于细胞的附着、扩散、迁移和分化等方面也具有调节作用。因此，模拟类似细胞外基质的干细胞生存环境，对于干细胞的扩增和应用有着重要作用。而3D纳米支架从产生发展到现在，其宗旨也是为了模拟这个细胞外基质的3D纤维网络。
3D纳米支架是一类由尺度在一定纳米范围(1~100nm)的基元微结构材料组成的3D高级结构，具有一定的机械支撑能力且力学性能可以调控。具有基元结构尺度跟细胞亚细胞结构匹配、易批量制备以及表面可进行多样性功能化修饰的特点，因而被广泛用于控制细胞行为[1-3]。伴随纳米技术的发展，最近十几年中，基于多种制备技术，如共价聚合、静电纺丝、3D打印等制备的各种天然或人工合成纳米支架材料被广泛应用于调控细胞，特别是干细胞的行为研究[4]。
理想情况下，用于干细胞培养的纳米支架需要满足以下要求：①没有细胞毒性；②能够与细胞生长的生理条件相容；③能够促进细胞之间以及细胞与底物的相互作用；④材料可以生物降解；⑤能够标准化、批量化生产和做应用前的处理；⑥能够人体内移植；⑦植入后尽量少地引起机体免疫反应或者炎症。常见的纳米支架材料包括天然高分子，如壳聚糖、明胶、胶原蛋白、透明质酸，以及人工合成高分子材料，如聚已内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-glycolic acid copolymer,PLGA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚乙烯醇( polyvinylaicohol,PVA)等[5,6]。此外，还有以纳米羟基磷灰石等无机材料为主体跟高分子材料复合而成的三维多孔支架，主要用于促进干细胞的成骨分化[7]。少数报道涉及 3D 石墨烯碳基纳米支架材料，则主要应用于神经干细胞的诱导分化[8]。下面从支架材料的种类、制备技术及作用原理等方面对干细胞培养纳米支架展开介绍。
壳聚糖是一种阳离子共聚物，通常通过几丁质的部分去乙酰化得到，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒、无致病菌以及较低的免疫原性，常作为一种抗微生物制剂以及保湿剂。壳聚糖很容易被加工成凝胶膜、纳米纤维、纳米粒子等。2008 年，Cho 等人用共价固定化的糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)制备壳聚糖支架，然后通过结合微环境控制因素来模拟骨髓微环境，用于脐带血干细胞的扩增[9]。其他的天然高分子，如明胶、透明质酸等虽然生物相容性好，但做成的水凝胶支架会带来力学和机械性能差的问题，一般要经过化学交联改性或跟其他聚合物复合后使用。Lee 等将甲基丙烯化的壳聚糖与透明质酸混合制备光交联水凝胶，包裹软骨细胞，发现可以在 21 天的长期培养中维持软骨细胞的表型和活性[10]。相比之下，人工合成髙分子具有更好的力学和机械性能及生物化学稳定性。聚已内酯(PCL)是一种无毒、具有良好生物相容性、生物可降解性的脂肪族聚酯，很容易被制成薄膜、纳米纤维、水凝胶等形态。2017 年，Mousavi 等证明 PCL 纳米纤维与细胞外基质成分的结合可以改善脐带血来源造血干细胞的扩增。他们认为，支架促进干细胞增殖的原因是聚己内酯纳米纤维和纤连蛋白的结合促进了细胞之间以及细胞和支架之间的相互作用，模拟了骨髓的理化和细胞微环境。并且，支架结构基元中富含的纳米纤维形成的 3D 网络结构提供了足够大的供细胞扩张的表面积，使细胞附着更好。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是由乳酸和羟基乙酸(glycolicacid,GA)单体共聚合成的，可通过调整两种单体的比例可调整聚合物的结晶度、力学性能和降解性能，被广泛应用于组织工程。如 Uematsu 等利用 PLGA 制备多孔支架，接种间充质干细胞，在兔子关节软骨缺损处进行实验获得了较好的成软骨效果[11]。聚对苯二甲酸乙二醇酯是一种重要的、应用广泛的工程热塑性材料聚合物，作为一种芳香族、半结晶的聚合物，具有高强度、高韧性的特点，此外还具有优异的力学性能和化学稳定性。它是由对苯二甲酸和乙二醇通过锑、钛或锗基催化剂聚合而成的，决定其最终机械性能的重要因素之一是聚合分子量的大小。Feng 等人评估了把 PET 制成薄膜和支架等不同几何结构结合蛋白质涂层策略对脐带血来源造血干细胞扩增的影响[12]。经过 10 天的培养后，研究人员发现，纤连蛋白结合的 PET 支架结构比薄膜结构在细胞扩增方面有更加显著的效果。因为 PET 支架更好地再现了骨髓微环境的三维结构。此外发现纤连蛋白比胶原蛋白能更有效地促进细胞附着。
静电纺丝是近些年构建支架材料重要手段。静电纺丝设备及操作流程相对简单，可以方便快速地实现直径从几十纳米到几微米不等的单一组分或者多种组分复合的纤维材料的制作，甚至量化生产。静电纺丝纤维形成的支架具有较大的表面积、丰富的多孔结构以及良好的机械支撑性能，非常利于干细胞的增殖和迁移。此外，细胞外基质中的某些蛋白质，如糖蛋白黏连蛋白和纤维连接蛋白等，可以很容易地沉积在静电纺丝纤维表面或者结合到纳米纤维中间，使支架更好地匹配细胞基质中的胶原纤维的作用，实现对细胞成长微环境的模拟。通过在静电纺丝纳米纤维表面负载生物活性物质，比如酶、DNA 和生长因子对静电纺丝进一步功能化，可以控制和增强种植在支架上细胞的增殖。此外，静电纺丝纳米纤维在定向诱导干细胞迁移方面也有其独特优势。细胞迁移作为一种独特的细胞行为，在许多生物学过程中也起着关键性作用，比如促进组织的再生和伤口的愈合。细胞迁移的关键过程包括膜蛋白的响应及细胞内的信号级连的建立、细胞骨架的重排到最终细胞的极化。细胞的整体迁移，可通过生化手段，如细胞外基质和生长因子或趋化因子等，利用机械力学作用来引导细胞极化。然而，静电纺丝所制备出来的纳米支架材料一般只在 2D 尺度上模拟了细胞外基质的结构，却不具有相互连接的多孔结构，阻碍了细胞向材料内的长入过程。最近 Ding,Greiner 和 Fong 等人报道了纳米 3D 气凝胶支架的制备方法，他们通过静电纺丝和冷冻干燥相结合的方法首先将纳米纤维膜剪切成小片，再将其制备成短纤维分散在溶液中，最后通过冷冻干燥成型得到 3D 纳米纤维支架[13]。
图1 掺杂纳米粘土材料的自支撑复合水凝胶打印过程
3D 打印作为一种新兴的前沿材料构建手段，近年来被广泛用于组织工程支架的构筑。其优点在于支架的组分、内部空间结构及外观形貌的可控性，可以更好地模拟人体组织的复杂分级结构及特异性。在构建组织工程支架方面，3D 打印技术和水凝胶成型技术、纳米技术紧密衔接，催生出种类繁多的支架材料。目前该领域的研究甚至可以将包载细胞的生物基质材料作为打印墨水，一体化成型为人造组织，为干细胞与再生医学带来了新的生机。Ghosh 等人利用明胶和丝素蛋白作为生物打印墨水，分别用超声预处理的物理交联以及基于酪氨酸酶的酶交联机制包埋干细胞，然后进行打印，通过对干细胞的表型进行研究，发现物理交联的 3D 支架有助于干细胞成骨表型表达，而酶交联的 3D 支架则由于力学性能较弱，干细胞倾向于向成脂肪细胞和成软骨细胞方向分化[14]。将无机的纳米黏土作为一种打印助剂，可以显著增强 3D 水凝胶支架的机械性能。刘文广团队利用甘氨酰胺丙烯酰胺单体(N-acryloyl glycinamide,NAGA)和纳米黏土作为打印材料，打印后光交联单体，获得的支架强度可达兆帕级别，并具有很好的弹性，可以作为骨修复材料[15]。
总之，纳米支架用于调控干细胞宗旨在于模仿干细胞在体环境的真实细胞基质。纳米支架材料一方面提供了一个具有一定机械强度的生物相容性三维空间，另一方面材料的纳米到亚微米尺度结构(如水凝胶孔隙的壁以及静电纺丝的纤维)为细胞的有效附着和铺展提供了大的表面积及尺度匹配的“抓手”。此外，支架对生物活性物质，比如酶、DNA 和生长因子的搭载及原位控释作用也有效地模拟了细胞生长微环境，对干细胞的存活、增殖和迁移起到了调控作用[16]。
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