在胰腺导管腺癌（PDA）的免疫治疗中，单一免疫检查点抑制剂（如抗 PD-1）尚未显示临床获益，但研究表明肿瘤组织中存在大量 CD8⁺ T 细胞。如何重新激活这些内源性 T 细胞的抗肿瘤活性是亟待解决的核心问题。一项发表于 《Clinical Cancer Research》 的研究利用多重免疫组化（mIHC）、T 细胞受体（TCR）测序及新鲜肿瘤组织切片培养技术，证实联合阻断 PD-1 与 CXCR4 可显著促进 CD8⁺ T 细胞向肿瘤周围迁移并杀伤肿瘤细胞，为胰腺癌联合免疫治疗提供了新策略。
研究背景
胰腺癌免疫治疗的困境与机遇
胰腺导管腺癌恶性程度高，传统免疫检查点抑制剂单药治疗无效。普遍观点认为这是由于肿瘤微环境中效应 T 细胞稀少、间质屏障致密所致。然而，近年研究发现人胰腺癌组织中实际存在大量 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞，且其浸润程度与患者预后正相关。因此，真正的障碍可能是 T 细胞被 “隔离” 在远离肿瘤细胞的纤维间质区，无法发挥杀伤作用。CXCR4-CXCL12 信号轴被认为参与介导 T 细胞在间质中的滞留。本研究旨在探索联合阻断 PD-1 与 CXCR4 能否重新激活并引导 T 细胞进入肿瘤实质。
研究核心
多重免疫组化与活组织切片培养联合验证
实验设计
图 1：多模式组化分析流程示意图。从 FFPE 块中连续切片，分别用于 TCR 测序和多重免疫组化（mIHC），并利用假 H&E 图像区分不同组织区域。
样本来源：收集 30 例未经新辅助治疗的人胰腺癌手术切除标本（来自 24 例患者）。
多重免疫组化（mIHC）：使用 徕卡 BOND RX 全自动染色平台 进行 6 色荧光染色（CD4、CD8、FOXP3、CD68、PD-1、细胞角蛋白等），结合 多光谱成像和 AI软件分析，评估不同组织区域（无癌间质、瘤周间质、淋巴组织等）的免疫细胞分布。
TCR 测序：从 FFPE 组织提取 DNA，检测 TCRβ 链 CDR3 区域，分析克隆扩增及氨基酸序列收敛进化。
新鲜肿瘤组织切片培养：将手术切除的新鲜肿瘤制成 250 μm 厚切片，在体外分别给予 IgG 对照、抗 PD-1 单抗、CXCR4 抑制剂（AMD3100）或两者联合处理 2–6 天。
检测指标：流式细胞术分析免疫细胞比例；检测上清细胞因子；活细胞共聚焦显微镜（Leica SP8X）动态观察 CD8⁺ T 细胞与肿瘤细胞（EpCAM⁺）的相互作用及凋亡（SR-FLICA 检测 caspase-3/7 活化）。
核心发现
瘤周间质呈现免疫抑制表型
图 2：瘤周区域含有更多免疫抑制性细胞。与无癌间质（S）相比，含癌间质（S-C）中 CD8⁺ T 细胞减少，Treg 和巨噬细胞增多（p<0.05，p<0.01）。
多重免疫组化显示：与无癌间质相比，含有癌细胞的瘤周间质中 CD8⁺ T 细胞浸润减少，而调节性 T 细胞（Treg）和巨噬细胞（CD68⁺）增多。CD8⁺ T 细胞在无癌间质中高表达 PD-1，提示这些 T 细胞虽被 “困” 于远处但仍处于活化潜能状态。
胰腺癌中存在克隆扩增且发生
收敛进化的 T 细胞
图 3：T 细胞在 PDA 微环境中克隆扩增并发生收敛进化。A. 各样本中前 100 个高频克隆的占比。C. 同一肿瘤不同区域优势克隆高度重叠。D-E. 多个不同 DNA 重排编码相同氨基酸序列。F. 氨基酸序列频率与对应 DNA 重排数量正相关。G-I. 克隆性与 Treg% 负相关，与 CD8% 正相关。
TCR 测序发现瘤内 T 细胞呈高度克隆性，且同一肿瘤不同区域优势克隆高度重叠。更重要的是，多个不同的 DNA 重排编码出相同的氨基酸序列（收敛进化），这是 T 细胞针对共同肿瘤抗原发生阳性选择的直接证据。克隆性与 CD8⁺ T 细胞浸润正相关，与 Treg 频率及 PD-1 表达负相关。
联合 PD-1 与 CXCR4 阻断可离体重激活
T 细胞并杀伤肿瘤
图 4：联合治疗增强 T 细胞介导的肿瘤杀伤。A. 联合治疗组 cleaved-Caspase-3 阳性细胞比例显著升高（p<0.01）。B-D. 联合治疗后 CD45⁺、CD4⁺、CD8⁺ T 细胞频率均升高。E. 优势 T 细胞克隆进一步扩增。F. 上清中 Granzyme B 和 IFN-γ 水平上升。
在新鲜肿瘤切片培养中，联合治疗组较单药或对照组显著增加 cleaved-Caspase-3 阳性凋亡细胞（p < 0.0001），同时 CD45⁺ 免疫细胞、CD4⁺ 及 CD8⁺ T 细胞频率均升高。TCR 测序显示优势克隆进一步扩增，上清中 Granzyme B 和 IFN-γ 水平升高，证实 T 细胞被再激活。
联合治疗快速诱导 CD8⁺ T 细胞
向瘤周迁移并直接杀伤肿瘤细胞
图 5：联合治疗将 CD8⁺ T 细胞（绿色）从纤维间质动员至瘤周，快速诱导肿瘤细胞（红色）凋亡（蓝色）。A-B. 联合治疗 2 天后，EpCAM⁺细胞 20μm 内 CD8⁺ T 细胞数量及邻近肿瘤凋亡比例增加。C-D. CD8⁺ T 细胞从纤维母细胞间质向瘤周区域转移。E-F. 动态成像显示：加入药物后 2 小时内即可观察到 CD8⁺ T 细胞迁移并诱发凋亡。
活细胞共聚焦显微镜显示：联合治疗 2 天后，EpCAM⁺ 肿瘤细胞周围 20 μm 内的 CD8⁺ T 细胞数量显著增加，且邻近的肿瘤细胞凋亡比例上升。动态时间序列成像发现，加入联合药物后 2 小时内 即可观察到 CD8⁺ T 细胞向肿瘤细胞迁移并诱发凋亡，而单药或对照无此效应。这表明联合治疗通过解除 CXCR4 介导的 T 细胞 “禁锢”，使预先存在的肿瘤反应性 T 细胞快速定位至肿瘤细胞并发挥杀伤作用。
关键样本支撑
徕卡 BOND RX 全自动染色平台
徕卡 BOND RX 全自动 IHC/ISH 染色系统
在本研究中，所有多重免疫组化（mIHC）实验均在 徕卡 BOND RX 全自动染色仪 上完成。该设备支持在同一张组织切片上同时检测多达 6 种标志物（CD4、CD8、FOXP3、CD68、PD-1、panCK），并通过自动化流程实现抗原修复、抗体孵育、TSA 信号放大等步骤，确保了结果的高度可重复性。
BOND RX 在本文中的突出作用：
全自动多重染色流程
研究者使用 BOND RX 配合多色荧光试剂盒，依次进行 6 轮染色，每轮包括封闭、一抗孵育、HRP 二抗、TSA 荧光信号放大以及高温抗体剥离（除最后一轮）。设备精准控温和自动液体处理，避免了人工操作误差。
高质量的空间表型分析
借助 BOND RX 获得的清晰、低背景的多色荧光染色切片，结合多光谱成像和AI分析软件，研究者能够区分无癌间质、瘤周间质、淋巴组织等不同微区域，并定量每个区域内 CD8⁺ T、Treg、巨噬细胞及 PD-1 表达。这是发现 “瘤周间质中 CD8⁺ T 细胞减少而 Treg 增多” 这一关键结论的技术基础。
支持临床样本的高通量处理
研究涉及 30 例临床手术标本，每例需进行 6 色染色。BOND RX 可同时运行30张切片，自动化流程显著缩短了手工操作时间，保证了批次间一致性。
总结
本研究首次在人胰腺癌新鲜组织中证明：联合 PD-1 与 CXCR4 阻断可快速将 CD8⁺ T 细胞从纤维间质 “动员” 至肿瘤周围，并诱导特异性肿瘤细胞凋亡。这一发现颠覆了 “胰腺癌缺乏免疫原性” 的传统观念，为临床试验提供了直接依据。其中，徕卡 BOND RX 全自动染色平台为精准解析肿瘤微环境中不同区域的免疫细胞组成提供了关键技术支撑，使得大规模、多标志物、高空间分辨率的免疫表型分析成为可能，是推动免疫治疗机制研究的重要工具。
参考文献
Seo YD, et al. Mobilization of CD8⁺ T cells via CXCR4 blockade facilitates PD-1 checkpoint therapy in human pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 2019.
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