引言
抗体设计是生物制药领域中的一个重要分支。表位（epitope）是抗原上能够被抗体识别的特定部分，而表位选择对于抗体设计至关重要，因为它直接影响抗体的特异性、亲和力、功能等关键性质，最终决定了抗体药物在临床上的有效性和安全性。当下靶点同质化非常严重，而基于特定的生物学机制，进行特定表位的抗体发现，有潜力带来更好的疗效以及更高的安全性，成为抗体设计差异化的重要来源。
当前主流的抗体发现手段，包括基于动物免疫的杂交瘤技术、单B细胞抗体发现技术、基于免疫或半合成文库的噬菌体展示等方法，依赖于动物体本身的免疫学机制以及抗体文库的质量，难以做到精准可控地靶向生物学机制所要求的特定功能表位。科迈生物基于生成式AI的抗体从头设计平台Click.mAb.，可实现针对特定抗原表位的精准抗体生成，同时生成的抗体具备全人源共轻链、多样化的亲和力范围等特点，有效避免了低免疫原性等困难表位带来的问题，为合作伙伴的抗体发现项目带来显著的差异化优势。
靶向特定表位的需求在抗体药物研发中广泛存在
鉴于抗原表位对抗体药物的重要性，科迈生物总结了以下几种需要靶向特定抗原表位的情况，供大家参考：
1、靶向特定的蛋白-蛋白相互作用界面：例如配体-受体结合界面，我们可能希望抗体靶向该界面，以实现阻断功能
2、非免疫优势表位：某些表位对于抗体功能至关重要，但本身免疫原性很低，难以通过动物免疫的方式获得期望的抗体。例如新冠病毒spike蛋白、疱疹病毒HSV-1 gB蛋白、呼吸道合胞病毒RSV的F蛋白等，存在高免疫原性表位，人体的免疫系统容易富集靶向这些表位的抗体，但病毒在这些表位容易发生免疫逃逸，不利于广谱中和抗体的研发。如果针对非免疫优势的保守表位进行抗体的发现，有潜力获得具备广谱中和活性的抗体
3、GPCR、离子通道等抗原结构复杂、暴露面积少的表位，同时由于多次跨膜类抗原蛋白表达制备困难，对基于动物免疫的抗体发现带来很大挑战
4、物种交叉活性相关表位：抗体结合在人源抗原蛋白的某个表位，但在鼠、猴等其他物种的同家族抗原蛋白中，该表位的保守性却很低，这种情况下很难通过改造已有抗体实现物种交叉活性。但如果在抗体发现的起始阶段，我们就选择在人、鼠、猴中都保守且具有功能的表位进行定向抗体设计，就较容易获得具备物种交叉活性的抗体
5、抗原结构在不同状态下，存在重大构象变化，产生特定的功能表位：典型的例子如下文将介绍的CD73靶点
6、由于肿瘤细胞和正常细胞的不同，导致的抗原差异化表位
a. 肿瘤组织中的特异性酶切，引起抗原构象变化，或者带来抗原结构的截短，导致不同细胞中抗原表位的差异
b. 糖基化修饰，造成特定表位被遮蔽
7、其他特殊生物学机制导致的差异化表位：例如单体、寡聚体、多聚体结构不同产生的不同表位
8、双抗、ADC以及最新的双抗ADC等药物形式对靶向特定抗原表位的要求：抗体结合的表位不同，影响ADC的内吞效率，以及双抗的药效
在后续的系列文章中，我们会对这些情况进行详细介绍和深入分析，欢迎大家在科迈生物后台留言探讨。
本文以抗肿瘤药物开发的明星靶点CD73为例，探讨抗原蛋白构象变化、结合到抗原结构上的不同表位将如何影响抗体药物的功能和药效，分析如何从结构的角度进行抗原表位的选择。
CD73概述-结构和功能
CD73又称为胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5’-Nucleotidase)，是由NT5E基因编码的一种催化AMP形成胞外腺苷的胞外酶。人CD73的基因位于染色体6q14-921，前体蛋白由574个氨基酸残基组成，其N末端第1-26位氨基酸残基及C末端第550-574位氨基酸残基被剪切后，第27-549位氨基酸残基序列即为成熟CD73，主要包括N端结构域(27-317AA)含2个锌离子结合位点和至少1个位于311位天冬氨酸的N-糖基化位点；C端结构域(337-549AA)含有底物结合位点，并通过GPI锚定器非共价结合到质膜上；N端和C端结构域通过一个短α螺旋(318-336AA)连接，通过短α螺旋可以控制酶的运动与开合状态。
CD73广泛分布在人体组织细胞表面，包括肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞等，发挥胞外核苷酸酶活性介导产生腺苷，进而调控核苷酸的信号传递。CD73同样表达于肿瘤微环境中的各类细胞，包括基质细胞、肿瘤细胞、免疫浸润细胞等。在肿瘤免疫微环境中特性之一是富含腺苷，细胞外具有免疫激活功能的ATP大量产生，ATP在CD39作用下脱磷酸产生AMP，进一步由CD73转变为具有免疫抑制的腺苷，从而产生免疫抑制的微环境，促进肿瘤生长。
CD73构象转化的分子机制
2012年Structure中解析了人类CD73的二聚体晶体结构，表明CD73存在“开放”和“闭合”两种构象状态，如Movie 1所示，两种构象状态下N端结构域和C端结构域的旋转角度可达114°，同时在开放构象二聚体间两个C端结构域发生链间旋转13°，影响二聚体间的分子相互作用。
Movie 1. 人源CD73二聚体开放和闭合构象转化（Structure, 2012, 20(12): 2161-2173.）
下图展示CD73在开放构象和闭合构象中的三维结构信息，犹如蝴蝶形状构型。开放构象：在这个构象中，CD73的一个亚基的N-末端和C-末端结构域分别以蓝色和绿色显示，相邻亚基的N-末端和C-末端结构域则分别以橙色和黄色显示。N端结构域包括一个金属离子Zn位点（灰色圆球标注），C端结构域包含一个底物AMP的结合位点（红色棒状标注），在开放构象也是非活性构象，金属离子和底物结合位点相隔较远，不能产生催化功能，这种构象通常与底物结合前的状态相关。闭合构象：在这个构象中，N端结构域会向下折叠，覆盖在C端结构域，N端的金属离子和C端的底物结合位点相互靠近，形成活性催化中心，进行底物的催化（Figure 1)。
Figure 1. 人源CD73晶体结构图（Structure, 2012, 20(12): 2161-2173.）
CD73在研管线情况总结
Table 1. CD73单克隆抗体在研管线信息汇总（数据来源：智慧芽https://www.zhihuiya.com/）
针对不同表位设计CD73抗体药物的案例分析
Oleclulab/MEDI9447
目前CD73抗体药物推进比较快的是AstraZeneca的Oleclulab（又称为MEDI9447），已进入3期临床研究。研究者们通过氢氘交换质谱（HDX）和突变策略等技术推测MEDI9447结合在CD73抗原N-端结构域，关键结合位点为V144、K180、N185，并且发现其双重抑制机制。MEDI9447通过其可变区的两个臂与CD73二聚体间的N-端结构位点相互作用，从而促进CD73二聚体间的桥接，两个二聚体相互牵制形成inter-dimer作用模式，阻止其从开放构象转变为活性的闭合构象，从而发挥对CD73的抑制效应（Figure 2)。
Figure 2. MEDI9447结合CD73示意图（MAbs, 2016, 8(3): 454-467.）
在MEDI9447酶活抑制数据中，MEDI9447 IgG开始可以以剂量依赖的方式抑制CD73活性，当MEDI9447与CD73二聚体摩尔比为1:1时对CD73活性抑制效应最强，表明在这个摩尔比下，每个CD73二聚体都能与一个MEDI9447 IgG分子结合，从而实现最佳抑制效果（黑色箭头）。当MEDI9447 IgG的浓度相对于CD73处于过量状态（>10 nM）时，观察到抑制效果的减弱，这种现象称为钩状效应（Hook Effect）。图中MEDI9447 一价Fab不能同时结合两个抗原，未表现出酶活抑制作用（Figure 3）。推测MEDI9447结合方式在抗原表面密度较低，或者抗体浓度过高时，一个抗体分子不能同时结合在两个CD73二聚体上，抗体无法把抗原牵制在固定的非活性构象，可能会出现随着N端旋转，CD73继续发挥酶活功能，即发生了Hook Effect。在MEDI9447药物临床试验中也观察到了Hook Effect。
Figure 3. MEDI9447对CD73酶活抑制效应（MAbs, 2016, 8(3): 454-467.）
临床进展：
在2021年AACR公布的临床试验数据中，Oleclumab与奥希替尼联合治疗T790M阴性EGFRm NSCLC显示出一定的疗效。在21名患者中，4例PR（19%），13例SD（61.9%），3例PD，还有1例患者的疗效未被评估。疾病控制率（DCR）达到了81%。中位无进展生存期（mPFS）为11个月，6个月的PFS率为63.5%，9个月的PFS率为52.9%。在生存率方面，6个月和9个月的总生存率（OS率）分别为100%和90%。与既往奥希替尼单药治疗的同类患者相比，联合治疗组的客观缓解率（ORR）相近（21%对比19%），但联合组的mPFS显著更长（11.0 vs 2.8个月）。
2021年ESMO上公布的Oleclumab联合PD-L1单抗Imfinzi（度伐利尤单抗）治疗肺癌大规模随机COAST II期临床试验结果显示：在接受同步放化疗（CRT）后病情没有进展的不可切除性III期NSCLC患者中，与Imfinzi单药治疗相比，Oleclumab或抗NKG2A单克隆抗体Monalizumab（莫那利珠单抗）与Imfinzi联合治疗改善了无进展生存期（PFS）和客观缓解率（ORR）。Imfinzi单药治疗组10个月PFS率为39.2%，Imfinzi+Oleclumab治疗组10个月PFS率为64.8%。与Imfinzi治疗组相比，Imfinzi+Oleclumab治疗组的ORR更高（30% vs 18%）。
2022年 Oleclumab 在国内首次获批临床试验，适应症为：与度伐利尤单抗联合治疗经根治性含铂类药物同步放化疗后未进展的局部晚期（III期）、不可切除非小细胞肺癌（NSCLC）。
Uliledlimab/TJD-5
Uliledlimab单抗是天境生物针对CD73差异化设计的单克隆抗体，通过冷冻电镜解析得到抗体结合在CD73二聚体C端结合界面，将CD73二聚体固定在开放和闭合之间的中间构象。Uliledlimab的这种结合相当于卡住两个单体发生构象转变的活动轴，通过占位将CD73锁定在非活性构象（Figure 4）。不同于MEDI9447的二聚体间结合模式，Uliledlimab二聚体内结合模式结合一个二聚体即可起效，避免了跨二聚体结合产生的“Hook Effect”。
Figure 4. Uliledlimab结合CD73结构图（I-mab, TJ004309 poster, ASCO 2021.)
下图中显示的是Uliledlimab与MEDI9447酶活抑制比较数据，随着抗体剂量增高，Uliledlimab可以达到100%酶活性抑制率，并且未发生Hook效应，而MEDI9447在抗体剂量持续增高时出现了Hook效应（Figure 5）。从该数据可以比较出，天境生物针对不同表位的差异化设计解决了量效背离的"Hook Effect"难题。
Figure 5. Uliledlimab与MEDI9447对CD73酶活抑制效应对比（I-mab, TJ004309 poster, ASCO 2021.)
临床进展：
在2021年ASCO年会上公布了Uliledlimab单抗的I期临床试验结果。这项研究中，Uliledlimab与PD-L1抑制剂阿替利珠单抗联合使用，治疗了20位实体瘤的患者。这些患者的中位治疗线数为3（线数范围1-9）。在13名能够评估疗效的患者中，有3名患者达到了完全缓解（CR）或部分缓解（PR），总体缓解率（ORR）为23%。此外，还有3名患者的病情稳定（SD），疾病控制率（DCR）达到了46%。Uliledlimab在试验中显示出良好的耐受性，没有出现剂量限制性的毒性反应。
在2023年ASCO会议上展示了CD73抗体Uliledlimab与PD-1抑制剂特瑞普利单抗联合作为一线治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的1b/II期临床试验的积极成果。在67名可以评估疗效的患者群体中，这种联合疗法实现了31.3%的客观缓解率（ORR）。特别在PD-L1阳性患者中，16例CD73高表达的患者ORR高达63%，而25例CD73低表达患者的ORR为20%。在进行了平均10.4个月的随访后，中位缓解持续时间（DOR）尚未确定，意味着可能患者的缓解效果持续存在。
Table 2. 阿斯利康Oleclumab与天境生物Uliledlimab部分临床数据对比
在治疗晚期NSCLC临床数据对比中发现，与阿斯利康的Oleclumab+度伐利尤联合治疗组的ORR30%相比，Uliledlimab单抗联合PD-1单抗特瑞普利单抗治疗在CD73低表达患者的ORR为20%，CD73高表达患者的ORR达到63%（Table 2)，相比Oleclumab，天境生物的Uliledlimab在联合治疗中取得更佳的临床效果，并且未发生钩状效应，同时也发现了CD73作为疗效预测的潜在生物标志物。
IPH5301
IPH5301是Innate pharma的一款针对CD73单克隆抗体，目前正在进行单独或联合化疗和曲妥珠单抗治疗晚期实体瘤患者的临床I期研究。通过负染观察到IPH5301全长抗体结合到CD73 N端结构域，并且以一个抗体结合一个CD73二聚体的比例结合（Figure 6A)，进一步晶体结构分析证实IPH5301两个Fab分别结合一个CD73二聚体的两个单体N端（Figure 6B)，考虑IPH5301抗体与CD73二聚体之间1:1的比例，推测IPH5301抗体结合在CD73开放构象会存在空间位阻（Figure 6C left)，更倾向IPH5301结合使CD73限制在开放向闭合状态转换的中间构象，导致结合在催化位点的底物无法水解（Figure 6C right)。同样是结合N端结构域，MEDI9447结合在N端结构域的外侧（inter-dimer binding mode)，IPH5301结合在N端结构域顶端（intra-dimer binding mode)，均需要同时固定抗原二聚体的两个N端，可能都会发生Hook Effect风险。
Figure 6. IPH5301结合CD73结构图（Cell Reports, 2019, 27(8): 2411-2425.）
TB19
TB19是Sanofi作为双特异性抗体的母本在开发，目前处于药物发现阶段。下图展示的是TB19与CD73复合物的结构示意图，晶体结构解析显示TB19 Fab的可变区域（Fv）与CD73的N端结构域相互作用，阻止CD73从部分开放状态转变为完全闭合的活性状态，两个结构域的角度呈现在开放和闭合的中间状态（Figure 7)。
Figure 7. TB19结合CD73结构示意图（J Biol Chem, 2020, 295(52):18379-18389.）
当TB19结合时，处于N端结构域与锌离子作用的His-220残基发生位置偏移，相对于闭合构象移动22Å，于开放构象移动27Å（Figure 8)。TB19 结合在N端结构域除CDRL2之外的CDR区域均邻近锌离子和磷酸盐离子结合位点，另外TB19 CDRH2残基Ser-62和CDRL1残基Ser-26空间上靠近C端结构域，与底物结合位点相差20 Å，TB19对活性位点的占位导致N端和C端空间位置无法靠近，难以发挥酶活催化作用。TB19的作用模式不依赖二价抗体发挥作用，理论上也降低了Hook Effect风险。
Figure 8. TB19与CD73结合空间排列（J Biol Chem, 2020, 295(52):18379-18389.）
IBI325
IBI325是信达生物针对CD73的单克隆抗体，适应症为晚期恶性肿瘤，目前处于临床1期。通过Epitope mapping分析IBI325结合CD73抗体的N端结构域，关键结合位点L159，Y161，K162，K163，V170。IBI325对CD73酶活抑制作用未发生Hook Effect，推测IBI325与CD73结合模式不同于Oleclumab结合模式（暂未有结构数据报道）（Figure 9)。
Figure 9. IBI325对CD73酶活抑制作用（Int J Biol Macromol. 2023 Feb 28:229:158-167.）
小结
从CD73靶点的多种抗体候选药物分析可以看出，CD73抗原表位的差异直接导致了抗体生物学活性的差异以及对临床应用的影响。CD73不同于一般抗原的“静态结构”，其激活态和失活态之间存在非常大的构象差异，采用CD73抗原进行动物免疫进行抗体发现时，我们无法提前知道和控制动物的免疫系统会针对哪种构象产生抗体，而基于特定的结构利用AI从头设计抗体，可以从分子机制层面出发，提前确定希望靶向的构象状态（激活态、失活态甚至中间态构象等）和相应的功能表位（N端、N端和C端的界面、底物结合位点等）。
从CD73的案例我们可以看出，对抗体药物的表位进行研究分析，可以更好地解释抗体底层作用机制，有利于抗体药物研究者们更好地根据作用机制进行药效预判；更为重要的是，不同表位为抗体药物的差异化设计提供了重要的起点。在生成式AI抗体从头设计平台的帮助下，针对我们期望的表位一键生成和设计具有良好亲和力和成药性的抗体，已经变为现实。科迈生物期待与各位朋友展开深度合作，利用AI抗体从头设计平台赋能抗体药物管线的差异化，实现更优的临床药效和安全性。
参考文献
1.Karen Knapp, Matthias Zebisch, Jan Pippel, et al. Crystal structure of the human ecto-5′-nucleotidase (CD73): insights into the regulation of purinergic signaling. Structure, 2012, 20(12): 2161-2173.
2.Geoghegan J C, Diedrich G, Lu X, et al. Inhibition of CD73 AMP hydrolysis by a therapeutic antibody with a dual, non-competitive mechanism of action. MAbs, 2016, 8(3): 454-467.
3.I-mab, The safety, pharmacokinetics (PK), pharmacodynamics (PD) and clinical efficacy of uliledlimab, a differentiated CD73 antibody, in combination with atezolizumab in patients with advanced cancer, ASCO 2021.
4.I-mab, Uliledlimab and Toripalimab Combination Therapy in Treatment Naïve Advanced NSCLC: Phase 1b/2 Clinical Trial Results Using CD73 as a Potential Predictive Biomarker, ASCO 2023.
5.Perrot I, Michaud H A, Giraudon-Paoli M, et al. Blocking antibodies targeting the CD39/CD73 immunosuppressive pathway unleash immune responses in combination cancer therapies. Cell Reports, 2019, 27(8): 2411-2425.
6.James E. Stefano, Dana M. Lord, Yanfeng Zhou, et al. A highly potent CD73 biparatopic antibody blocks organization of the enzyme active site through dual mechanisms. J Biol Chem, 2020, 295(52):18379-18389.
7.Ying Zhou, Haoran Shen, Min Wu, et al. Pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity characterization of a novel anti-CD73 therapeutic antibody IBI325 for cancer immunotherapy. Int J Biol Macromol. 2023 Feb 28:229:158-167.
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关于科迈生物
科迈生物是一家专注于利用生成式AI模型进行抗体设计的科技生物企业（TechBio），创始股东为晶泰科技和百奥赛图，于2021年6月成立，并于当年9月完成了近千万美元种子轮融资。科迈生物基于深度学习技术，在以内部积累的大量配对抗原、抗体序列及结构数据进行训练的基础上，形成基于指定抗原表位生成高亲和力、全人源共轻链抗体的数据驱动的差异化抗体发现解决方案，旨在解决当前抗体药物的早期发现中，对于特定的功能表位、低免疫原性表位、高度同源和保守表位、特定构象的表位、难以表达制备和免疫的抗原等场景下的抗体难以获得的问题。在一个内部测试案例中，Click.mAb.平台针对指定的抗原表位生成了具备高亲和力（KD优于10 nM）的抗体，且通过冷冻电镜获得的抗原-抗体复合物结构表明，抗原表位符合预期。
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