引言
表位选择在抗体设计中起着至关重要的作用，因为它直接影响抗体的特异性和生物学功能等关键性质，最终决定了抗体药物在临床上的有效性和安全性。在抗体与抗原的相互作用中，表位作为抗原分子上被抗体识别的特定区域，其结构和性质决定了抗体的靶向性和效果。一个精心挑选的表位可以赋予抗体高度的特异性，使其能够精确地识别和结合目标分子，从而在治疗疾病、诊断条件或研究生物学过程中发挥关键作用。然而当下靶点同质化非常严重，而基于特定的生物学机制，进行特定表位的抗体发现，有潜力带来更好的疗效以及更高的安全性，成为抗体设计差异化的重要来源。
选定了希望靶向的功能抗原表位之后，如何获得精准靶向该表位的抗体？当前主流的抗体发现手段，包括基于动物免疫的杂交瘤技术、单B细胞抗体发现技术、基于免疫或半合成文库的噬菌体展示等方法，依赖于动物体本身的免疫学机制以及抗体文库的质量，难以做到精准可控地靶向生物学机制所要求的特定功能表位。
随着科学技术的进步，尤其是计算生物学和机器学习在生物医药领域的应用，靶向特定表位的抗体设计已经成为现实，有望推动新一代治疗性抗体的研发，为患者带来更有效、更安全的治疗方案。科迈生物基于生成式AI的抗体从头设计平台Click.mAb.，可实现针对特定抗原表位的精准抗体生成，同时生成的抗体具备全人源共轻链、多样化的亲和力范围等特点，有效避免了低免疫原性等困难表位带来的问题，为合作伙伴的抗体发现项目带来显著的差异化优势。
本期案例研究我们将对一个老靶点（HER2）新视角（双表位双抗）分析抗原表位选择如何影响抗体药物的功能和药效，由于单一表位的抗体在某些情况下无法充分抑制肿瘤的作用，为了克服这一局限性，双表位双抗在分子水平上产生更复杂的相互作用和更高效的治疗效果，实现了“1+1>2"的作用效果。
HER家族概述
人表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族（EGFR）包含四个成员：ErbB1（EGFR/HER1），ErbB2（HER2），ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4）。这类家族成员主要由三个结构域组成：一个富含半胱氨酸的胞外域（ECD）、一个亲脂性跨膜域（TMD）和一个具有酪氨酸激酶催化活性的胞内区域（ICD）。胞外域包含四个结构域（I-IV），结构域I和III为配体结合位点，结构域II和IV富含半胱氨酸，可形成同源或异源二聚体。在没有配体的情况下，ECD呈现一种封闭构象（抑制构象），结构域II和IV相互作用，阻挡了结构域II处的二聚化臂向外延伸，无法与HER家族其他受体形成同源或异源二聚体。当配体结合在结构域I和III之间时，ECD呈现一种开放构象（激活构象），结构域II中的二聚化臂向外延伸，形成受体同源或异源二聚体，激活胞内酪氨酸激酶活性及下游信号传导，主要通过MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR途径促进生长、增殖和分化等（Figure 1）。
Figure 1. HER家族成员结构 (Crit Rev Oncol Hematol. 2022, 174: 103681.)
HER2结构特征
HER2基因位于染色体17q21，编码1255个氨基酸，分子量为185kDa，是一种受体酪氨酸激酶。HER2在HER家族中是独特的，因为没有已知的配体，并且不能组装成依赖配体的二聚体。因此，为了促进下游信号传导，它必须在其他HER蛋白的特定配体结合后形成与其他HER蛋白的异源二聚体，或者在过表达的条件下自组装成配体独立的同源二聚体。在含有HER2的异源二聚体中，EGFR/HER2和HER2/HER3是最为相关的组合，因为它们对细胞功能和疾病产生非常重要的影响，并且与多种癌症的发展有关。
研究者通过X射线晶体学方法解析了ErbB2胞外区的一个截短形式（残基1-509）的三维结构，晶体结构显示ErbB2胞外区L1（结构域I）和L2（结构域III）呈现出一种紧凑的双叶结构，遮蔽了潜在的配体结合位点，与未激活的EGFR或ErbB3胞外区呈现的开放状态构象不同（Figure 2），反而与EGFR结合配体时的构象相似。这种构象表明ErbB2已经处于一种持续激活状态，与其他激活的EGFR家族成员相互作用。
Figure 2. ErbB2与EGFR，ErbB3胞外区截短体结构比较 (Molecular Cell, 2003, 11: 495–505.)
当ErbB2(1–509)的L2结构域与EGFR(1–501)的L2结构域进行重叠比较时，发现ErbB2 L1结构域的方向有所不同。这种不同对应于两个主要的变化：(1) L1结构域围绕一个与其大β层平行的轴线顺时针旋转了大约35°；(2) L1结构域向CR1（结构域II）结构域方向移动了7Å。因此，在ErbB2中，L2上的大β折叠片的底部紧靠着L1的N端（残基1-33）（Figure 3）。L结构域位置的变化可能是由于CR1结构域中的弯曲（折叠）以及CR1/L2界面处的弯曲造成的。在这种构象中，类似于EGF的配体无法结合到ErbB2的L1或L2结构域的潜在配体结合位点，因为每个位点都被对立的L结构域所阻塞。
Figure 3. ErbB2(1–509) 和EGFR(1–501)主链轨迹比较（蓝色为ErbB2，棕色为EGFR，B图是将A图沿垂直轴-90°旋转展示CR1区，黑色细线部分为结合的配体，Molecular Cell, 2003, 11: 495–505.)
ErbB2特有的胞外域结构观察到L1/L2相互接触，CR1/L2区域起稳定作用，并且CR2（结构域IV）中序列的差异破坏了折叠回的构象。在ErbB3中看到的折叠回构象通过一个主链/主链氢键以及CR1环中的Tyr246、Phe251和Gln252与CR2中的Asp562/Lys583，Gly563/His565之间的侧链相互作用来稳定。这些接触残基在EGFR，ErbB4中是保守的，但在ErbB2中七个残基有三个不同，Glu259代替Glu252，Pro572代替Gly563，Phe574代替His565。特别是除ErbB2外，Gly在所有受体中都是保守的。在ErbB2这个位置的Pro不仅会与Phe258发生立体冲突，还会扰乱其他关键残基的构象，尤其是Asp571和Pro573，以至于折叠回的相互作用无法发生。在ErbB2的L1结构域中，Arg13（对应EGFR中的Thr）位于配体结合位点附近，Arg13的存在可能会限制L1结构域构象变化，使得配体结合位点无法正确形成，同时这个位置侧链相对较大，阻止配体分子的接近和进入配体结合位点。同时在ErbB2的CR1/L2铰链区中，保守的Arg413（在EGFR中是Arg405）是关键的相互作用残基，有助于稳定ErbB2激活构象，从而促进二聚体的形成。
HER2过表达与肿瘤发生发展的关系
HER2在多种实体瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌，子宫癌、宫颈癌、胆道癌等多个瘤种均存在异常表达，约20-30%乳腺癌、胃癌和胆管癌中均观察到HER2异常（Figure 4），并且与更具侵袭性的疾病和不良预后有关，因此HER2被公认为重要的肿瘤治疗靶点之一。
Figure 4. 在不同肿瘤类型HER2变异的频率 (Nat Rev Clin Oncol. 2020, 17(1):33-48. )
HER2单抗药物
目前靶向HER2药物主要集中在单克隆抗体药物，在单抗基础上开发的ADC，还有TKI类药物（Figure 5）。
Figure 5. 已上市HER2靶点药物（数据来源：cortellis）
曲妥珠单抗
曲妥珠单抗Trastuzumab，商品名 Herceptin，1998年FDA批准上市的第一款针对HER2的单克隆抗体药物，2000年在欧洲获批上市。曲妥珠单抗结合到HER2受体胞外区结构域IV上，其比较明确的作用机制是增加HER2磷酸化，抑制HER3磷酸化，抑制PI3K/AKT信号通路，和抗体依赖的ADCC效应促进免疫系统对肿瘤细胞的攻击。曲妥珠单抗对配体非依赖HER2激活模式的抑制作用目前还存在争议，有待于进一步研究。
帕妥珠单抗
帕妥珠单抗Pertuzumab，商品名Perjeta，2012年FDA批准上市的另一款针对HER2的单克隆抗体药物。这一发现归功于几项关键研究的结果，包括NeoSphere、APHINITY和CLEOPATRA试验。这些研究证明，与曲妥珠单抗（Trastuzumab）联合使用的帕妥珠单抗（Pertuzumab）方案能够进一步改善治疗效果并延长HER2阳性乳腺癌患者的生存期。帕妥珠单抗通过特异性结合在HER2受体胞外区结构域II上，从而在空间上阻断了二聚化臂介导的HER2二聚化，二聚化的抑制将导致HER2激活的阻断以及HER2介导下游信号传导的阻断。
马吉妥昔单抗
马吉妥昔单抗Margetuximab，商品名Margenza，MacroGenics公司开发的一款靶向HER2的Fc优化型单克隆抗体。2020年FDA基于SOPHIA研究批准马吉妥昔单抗在美国上市，用于治疗已经接受过至少两种其他HER2靶向治疗（包括曲妥珠单抗）的转移性HER2阳性乳腺癌患者。2023年马吉妥昔单抗注射液在我国获批上市，适用于转移性HER2阳性患者的三线及以上治疗。马吉妥昔单抗具有与曲妥珠单抗相同的结合位点（结构域IV），同时在Fc端进行优化改造增强了对激活型Fc受体亲和力，降低对抑制型Fc受体亲和力，从而增强了ADCC效应。
HER2双表位抗体药物
未被满足的临床需求
受限于曲妥珠单抗的耐药性，结合不同表位的帕妥珠单抗已与曲妥珠单抗和多西他赛联合应用，又称“双妥联用”，可以协同阻止HER2活性，增强ADCC效应，抑制肿瘤生长（Figure 6）。虽然帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和多西他赛的联合使用取得了更好的治疗效果，但受益于该治疗的HER2阳性患者的比例仍然较低。基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双表位的作用机制和协同作用对于开发新型疗法以提高疗效至关重要。
Figure 6. “双妥联用”作用模式（Cancers 2018, 10, 342.）
双表位双抗的开发
基于已知的双表位，Zymeworks开发了一款同时结合非重叠HER2双表位（ECD2和ECD4）的非对称结构双抗Zanidatamab（ZW25)（Figure 7)，与曲妥珠单抗和“双妥”组合相比具有增强功能，这与其独特的设计密切相关：
• 首先，两个结合表位具有双重阻断HER2信号；
• 其次，更具独特性的是，区别于曲妥珠单抗一个抗体结合位点结合一个HER2分子的cis结合方式，Zanidatamab以trans结合方式，一个抗体结合两个HER2分子，且不同的抗体-HER2复合物之间可形成交联。该结合方式可以通过解离速率Koff值进行验证，如果与曲妥珠单抗相同的cis结合方式，其Koff值与抗体密度无关；如果是trans结合方式，Koff值会随着芯片表面抗体密度的增加而降低（Figure 8a），因为在高抗体密度下，两个Zanidatamab分子可以通过它们的结合位点ECD2和ECD4跨接两个HER2分子，形成交联。实验结果验证Zanidatamab以trans结合方式结合HER2分子（Figure 8b），使得抗体的解离速度降低，表现出更高亲和力，这一结果在分析超离心和冷冻电镜中得到进一步验证；
• 第三，Zanidatamab的trans结合体现出的另一优势是可以在细胞膜表面将更多的抗原抗体分子交联成簇形成稳定的六聚体复合物，增强HER2内吞至胞内溶酶体降解，并且由于Fc结合位点增加引起更为有效的CDC、ADCC和ADCP效应。
Figure 7. ZW25结构示意图（Nat Commun. 2023 Mar 13;14(1):1394.）
Figure 8. ZW25以trans方式结合HER2（Nat Commun. 2023 Mar 13;14(1):1394.）
Zanidatamab展示出多种作用机制，为其在临床试验表现提供了合理的依据（Figure 9)。
• Zanidatamab以trans方式与邻近的HER2结合，产生独特的HER2聚集方式，如在细胞表面形成HER2极化帽和形成稳定的抗原抗体成簇六聚体复合物，募集更多补体激活CDC活性杀伤肿瘤细胞；
• Zanidatamab介导更强的ADCC和ADCP效应发挥杀伤或吞噬肿瘤细胞；
• Zanidatamab双重阻断同源和异源二聚体的形成，抑制肿瘤细胞信号传导和肿瘤生长；
• Zanidatamab介导HER2内化，胞内降解和信号抑制
Figure 9. ZW25多种作用机制（Nat Commun. 2023 Mar 13;14(1):1394.）
临床进展及与“双妥联用”数据对比
在2019年的ESMO/ESMO ASIA会议上，百济神州和Zymeworks公司合作在研针对HER2双特异性抗体ZW25（Zanidatamab）的I期临床研究结果显示，在多种类型的肿瘤患者中，总体的客观缓解率（ORR）达到了43.9%，疾病控制率（DCR）为70.2%。特别是在胆管癌患者中，Zanidatamab的疗效更为显著，客观缓解率高达66.7%，疾病控制率达到了77.8%。患者群体的中位无进展生存期（mPFS）是5.5个月（95%CI 3.6-6.4），且该数据还在进一步的评估过程中。在安全性方面，所有不良反应均为1级或2级，未出现3级以上不良反应，表明Zanidatamab具有较好的耐受性。
在2021年美国临床肿瘤学会胃肠道肿瘤研讨会（ASCO GI）上公布的Zanidatamab治疗HER2阳性胆道癌（BTCs）的I期研究中，对20名可评估疗效的患者进行了分析。结果显示，确认的客观缓解率（cORR）ORR为40%（N=8；95% CI：29.2，63.9），疾病控制率（DCR）达到了65%（N=13），中位缓解持续时间为7.4个月。在耐受性方面，Zanidatamab整体上表现出良好的安全性，无3级或以上药物相关的不良事件。在参与研究的20名患者中，有15例（72%）发生了Zanidatamab相关的不良事件，但严重程度均为1级或2级。
2023 ASCO报告了HERIZON-BTC-01（NCT04466891）研究结果，这是一项全球性、多中心、单臂、2b期试验，用于评估Zanidatamab治疗HER2-扩增、不可切除、局部晚期或转移性胆道癌的疗效。入组87例患者，在队列1中（n=80)，确认的客观缓解率（cORR)为41.3%，中位缓解持续时间（DOR）为12.9个月，中位随访时间为12.4个月，疾病控制率（DCR）为68.8%，中位无进展生存期（mPFS）为5.5个月。在33名应答者中，49%的患者有持续应答，82%的患者有持续超过16周的应答。首次反应的中位时间为1.8个月。
Table 1. Zanidatamab与“双妥联用”临床数据对比：
Table 1.中通过Zanidatamab单药与“双妥联用”临床数据对比看出，Zanidatamab在治疗HER2扩增或过表达的胆管癌、直肠癌和胃癌等多种实体瘤中表现出了更优的客观响应率（ORR）、中位无进展生存期（mPFS）和疾病控制率（DCR），其中在2016年Zymeworks/BeiGene的研究中，Zanidatamab在多种实体瘤尤其是胆管癌的ORR最高，达到66.7%，DCR达到77.8%，展示出在胆道肿瘤治疗方面有着非常积极的疗效。从这些数据可以看出，Zanidatamab在某些适应症中的疗效可能优于传统的“双妥联用”疗法。
小结
从HER2双表位双抗开发的案例发现，由于针对HER2单表位抗体的曲妥珠单抗在用药一年出现明显的耐药性，在与帕妥珠单抗联用虽然药效得到明显的提升，但受益于该治疗的HER2阳性患者的比例仍然较低。靶向ECD2和ECD4双表位的HER2双特异性抗体Zanidatamab凭借独特精巧的设计，展示多方面作用机制，获得了更为积极的临床表现，目前美国FDA已授予了Zanidatamab突破性疗法认定，及治疗胆管癌、胃癌和卵巢癌的孤儿药资格。
对于抗体药物的表位进行研究分析，可以更好地解释抗体底层作用机制，有利于抗体药物研究者们更好地根据作用机制进行药效预判；更为重要的是，不同表位为抗体药物的差异化设计提供了重要的起点。在生成式AI抗体从头设计平台的帮助下，针对我们期望的表位一键生成和设计具有良好亲和力和成药性的抗体，已经变为现实。科迈生物期待与各位朋友展开深度合作，利用AI抗体从头设计平台赋能抗体药物管线的差异化，实现更优的临床药效和安全性。
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10. 智慧芽 https://www.zhihuiya.com/
关于科迈生物
科迈生物是一家专注于利用生成式AI模型进行抗体设计的科技生物企业（TechBio），创始股东为晶泰科技和百奥赛图，于2021年6月成立，并于当年9月完成了近千万美元种子轮融资。科迈生物基于深度学习技术，在以内部积累的大量配对抗原、抗体序列及结构数据进行训练的基础上，形成基于指定抗原表位生成高亲和力、全人源共轻链抗体的数据驱动的差异化抗体发现解决方案，旨在解决当前抗体药物的早期发现中，对于特定的功能表位、低免疫原性表位、高度同源和保守表位、特定构象的表位、难以表达制备和免疫的抗原等场景下的抗体难以获得的问题。在一个内部测试案例中，Click.mAb.平台针对指定的抗原表位生成了具备高亲和力（KD优于10 nM）的抗体，且通过冷冻电镜获得的抗原-抗体复合物结构表明，抗原表位符合预期。
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