

产品包装:SafeRed® 10000x Nucleic Acid Dye 500uL/⽀;
储存条件:室温或4℃避光可保存24个⽉。
⼀.胶染法(预染法,⽤法EB完全相同)
制胶时加⼊SafeRed 核酸染料(染料灵敏,每100mL 琼脂糖溶液中加⼊10μL SafeRed 原装液即可)。按常规⽅法电泳。
1. 实验室材料和试剂:
(1) 实验样品:质粒 DNA,DNA marker(国产的 DNA marker 浓度太⾼,⾄少稀释 2~3 倍后使⽤)
(2) TBE 缓冲液配置:10X TBE 电泳缓冲液[Tris 107.8146g (890mM),硼酸 55.0287g(890mM),EDTA 5.845g(20mM),加 NaOH 约 4g 调节 pH=8.3;定容 1000mL];⽤ ddH2O 稀释 10 倍配制 1X TBE 电泳缓冲液。
(3) TAE 缓冲液配置:50X TAE 电泳缓冲液[Tris 242g (2M),EDTA 37.2g(100mM),加醋酸约 57ml 调节 pH=8.5;定容 1000mL];⽤ ddH2O稀释 50 倍配制 1X TAE 电泳缓冲液。
(4) 溴酚蓝指示剂,1%的⻄班⽛琼脂糖凝胶
(5) 仪器:电泳仪(130v),移液器(0.5~10ul),凝胶成像仪
2. 实验步骤:
(1) 制胶:将 0.5g 琼脂糖溶于 50mL 1X TBE 电泳缓冲液中,加热⾄琼脂糖完全融化。将融好的琼脂糖溶液室温放置 50℃左右加⼊ 5uL 的 SafeRed 凝胶电泳染料,摇匀。
(2) 倒胶:将制好的琼脂糖凝胶缓慢倒于制胶托盘内,避免产⽣⽓泡。将点样梳⼦垂直置于电泳胶膜的⼀端,距离托盘底部约 1mm。放置时尽量保持平稳,切勿晃动。
(3) 置胶:待约 30 分钟左右胶体充分凝固后,缓慢垂直向上拔起点样梳⼦,切勿⽤⼒过猛。(夏季适当延⻓凝胶时间)
(4) 将琼脂糖凝胶放⼊电泳槽内,加⼊电泳缓冲液,使电泳缓冲液液⾯⾼于凝胶⾯约 1~2mm。
(5) 将混合溴酚蓝指示剂的 DNA 样本(1ul 溴酚蓝与 2ul DNA 标本混合)加⼊到点样孔内。
(6) 盖上电泳槽盖,开启电源,使 DNA 从负极移向正极恒压电泳(电压恒定在 120~130v 之间,⼀般可选择 130V)。
(7) 当 DNA 条带距离点样孔约 1~2cm 后关闭电源,(约 30~40 分钟)取出凝胶。
(8) ⽤ 302nm 激发的 UV 凝胶成像系统观察结果。
*注:此方法染色染料用量相对较少。染料加入胶中可直接使用微波炉加热,制好的胶溶液可以在室温下保存直至用完。
⼆.泡染法(后染法)
注意:泡染出现的条带弯曲和拖带的现象与样品的质量和凝胶的浓度有关,并不是染料的问题!泡染比预染适当提高琼脂糖凝胶浓度约0.2%-0.3%。
(1) 按照以上常规⽅法进⾏电泳。用于胶回收等高浓度DNA样品强烈推荐泡染法!
(2) 将SafeRed® 10,000×储液稀释约10000倍到0.1M NaCl溶液中制成1×染⾊液。(例如将5μL SafeRed® 10,000×原装液加⼊到50mL 0.1M NaCl溶液中)。
(3) 将凝胶⼩⼼地放⼊合适的容器中(如聚丙烯容器中)缓慢加⼊⾜量的3× 染⾊液浸没凝胶。室温振荡染⾊30min左右,最佳染⾊时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同⽽略有不同。对于含1%的凝胶,染⾊时间约30min。
(4) ⽤ 302nm 激发的紫外凝胶成像系统观察结果。
*注意事项:用泡染法染色时,染料用量较多。3× SafeRed®染色液室温避光保存,可重复使用3次左右。
三.核酸电泳的PAGE步骤:
1) 将TBE制备的凝胶放⼊电泳槽中,⽤夹⼦夹住边缘。
2) ⽤配置凝胶溶液同⼀批次的5×TBE灌满缓冲液槽。⽤注射器排除凝胶底部的⽓泡。
3) ⽤注射器吸取1×TBE冲洗加样孔。将DNA样品和适量的6×凝胶上样缓冲液混合,⽤微量移液管加⼊加样孔。
4) 将电极与电源相连(正极接下槽),打开电源⼀般90V;1~8V/cm。进⾏电泳9h。
5) 电泳⾄标准参照染料迁移⾄所需位置(⼀般是电泳到⼆甲苯完全迁出,溴酚蓝距底边2~3cm停⽌)。关闭电源,拔掉插头,弃去电泳槽中的电泳液。
6) 将凝胶取下来放⼊,染⾊⽫中,加3X SafeRed的1X缓冲液中的振荡染⾊30-60分,放置在紫外检测即可。
*注意事项:PAGE不能用预染或点染的方法;只能用泡染的方法显色,由于聚丙烯酰胺比较致密,染料不容易深入,显色效果没有琼酯糖凝胶好。
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