不同品种和不同季节土牛膝中总皂苷、竹节参皂苷Ⅴ及

竹节参皂苷Ⅳa 的含量测定研究

曾琼丽 1，2，张恒 1，2，肖炜婷 1，2，阳素 1，2，杨蒂 3，韩越 1，2，王雄龙 3，李顺祥 1，欧阳文 1，4，5

（1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2. 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙410208；

3. 湖南时代阳光药业股份有限公司中成药复杂作用解析湖南重点实验室，湖南 永州410116；4.湖南中医药大学附属第二中西医结合医院科教科，湖南 浏阳 410300；5. 湖南省浏阳市中医医院科教部，湖南 浏阳 410300）

摘要：目的 考察不同品种土牛膝之间相关特征皂苷成分含量随季节变化的规律。方法 采用UV比色法测定4~12月份采收的粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中总皂苷含量，HPLC法测定其竹节参皂苷Ⅴ 、竹节参皂苷Ⅳa的含量。结果 野生牛膝种总皂苷及竹节参皂苷Ⅴ含量均值（3. 147%，0. 176%）高于粗毛牛膝（2.841%，0.076%）与柳叶牛膝（2.762%，0.033%），柳叶牛膝中竹节参皂苷Ⅳa的含量均值（0. 191 %）明显高于野生牛膝（0. 161%）和粗毛牛膝（0. 103%）。 结论 粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种之间总皂苷、竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa含量存在明显差异，采收时期对竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa含量有重要影响，一般于秋季含量较高，冬季含量显著降低，与传统采收期基本一致。

关键词：土牛膝；竹节参皂苷Ⅴ；竹节参皂苷Ⅳa；含量测定

中图分类号：R284.1 文献标识码：A DOI：10. 3969/j. issn. 1008 987x. 2025. 01. 12

Study on the determination of total saponins, chikusetsusaponin Ⅴ and chikusetsusaponin Ⅳa in different varieties and seasons of Tu Niu Xi

ZENG Qiong-li1，2, ZHANG Heng1，2, XIAO Wei-ting1，2, YANG Su1，2, YANG Di3, HAN Yue1，2, WANG Xiong-long3,

LI Shun-xiang1, OUYANG Wen1，4，5

（1.School of Pharmacy, Hu ’nan University of Chinese Medicine, Changsha 410208; 2.Key Laboratory of Modern Research

of TCM of Hu ’nan Province, Changsha 410208; 3. Hu ’nan Key Laboratory of Complex Action Analysis of Proprietary

Chinese Medicine, Hu ’nan Time Sun Pharmaceutical Co. Ltd., Yongzhou 410116; 4. Department of Science and Education,

The Second Affiliated Hospital of Hu ’nan University of Chinese Medicine, Liuyang 410300; 5. Ministry of Science and

Education, Liuyang Hospital of TCM, Liuyang 410300）

Abstracts: Objective To investigate the seasonal variation of saponin content among different varieties of Tu Niu Xi. Methods UV colorimetric method was used to determine the total saponin content in Achyranthes aspera Linn., Achyranthes longifolia Makino,and wild Achyranthes bidentata Blume collected from April to December. HPLC method was used to determine the content of chikusetsusaponin Ⅴ and chikusetsusaponin Ⅳa. Results The average content of total saponins and chikusetsusaponin Ⅴ in wild A. bidentata Blume.（3 . 147%, 0 . 176%）was higher than that in A. aspera Linn.（2 .841%, 0 .076%）and A. longifolia Makino（2 .762%, 0 .033%）. The average content of chikusetsusaponin Ⅳa in A. longifolia Makino（0 . 191%）was significantly

higher than that in wild A. bidentata Blume（0 . 161%）and A. aspera Line. Conclusion There are significant differences in the total saponin, chikusetsusaponin Ⅴ, and chikusetsusaponin Ⅳa content among the A.aspera Linn ., A. longifolia Makino, and wild A. bidentata Blume. The harvesting period has an important impact on the content of chikusetsusaponin Ⅴ and chikusetsusaponin Ⅳa. Generally, the content is higher in autumn and significantly lower in winter, which is basically consistent with the traditional harvesting period.

Keywords: Tu Niu Xi; Chikusetsusaponin Ⅴ; Chikusetsusaponin Ⅳa; Content determination

土牛膝最早见于《本草纲目》，又称之为倒钩草、倒梗草、牛舌头、鱼鳞草等，为我国常见的特色民族药材［1］，主产于湖南、江西、安徽、台湾、福建等地，国外印度、越南、菲律宾、马来西亚等地亦有分布，常于秋冬季地上部分枯萎或早春发苗时节采挖［2］。土牛膝植物来源主要包括苋科 粗 毛 牛 膝（Achyranthes aspera Linn.）、柳 叶 牛 膝（Achyrantheslongifolia Makino）及牛膝野生种（Achyra nthes bidentata Blume）的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、泻火解毒、祛湿利尿的功效，民间用于治疗咽喉肿痛、白喉、疮痈、产后腹痛、湿热痢疾等症［3-4］。

20世纪90年代，国医大师梅国强教授自拟经验方“四土汤”中使用土牛膝这一味药材，在临床上治疗湿热邪毒及痰瘀互结所致疮毒、癌肿等疑难顽疾近30年，具有良效［5-6］。现代药理研究表明，土牛膝具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、抗生育、降血糖血脂、神经保护以及免疫调节等多种药理活性，是一种价值丰富的药用植物［7-12］。苋科牛膝属植物中三萜类化合物种类繁多、结构多样，为主要活性物质，其中土牛膝以齐墩果烷型三萜皂苷类化合物为主要成分。而2020版《中国药典》中牛膝含量测定项下仅见β-蜕皮甾酮不得少于0.030 %，过于单一，无法准确反映药材的整体质量，且少数关于牛膝中皂苷类成分的研究主要集中在竹节参皂苷Ⅴ和竹节参皂苷Ⅳa，但缺少同时测定这两种成分含量的简单高效分析方法［13-14］。基于以上背景，本研究拟采用UV比色法测定4~12月采收的粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中总皂苷含量，采用HPLC法建立同时测定竹节参皂苷Ⅴ和竹节参皂苷Ⅳa两种成分含量的方法，对3种土牛膝中特征皂苷类成分的差异性进行分析，为研究土牛膝皂苷类物质含量随季节变化规律提供依据，为土牛膝药材采收、质控及后续深入研究提供参考。

1 材料

1.1 实验药材

粗毛牛膝和柳叶牛膝采自湖南永州马鞍岭瑶家寨湖南时代阳光药业股份有限公司种植基地，牛膝野生种采自湖南长沙湖南中医药大学药用植物园。

1.2 仪器与试剂

ME204E型万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）； 数显恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；N-1300V-W型旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；T2602FC型紫外仪（上海佑科仪器仪表）；LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）； C18色谱柱（日本YMC公司）。

竹节参皂苷Ⅳa、竹节参皂苷Ⅴ对照品购于成都普思生物科技股份有限公司，纯度>98%；冰醋酸购于国药集团试剂有限公司；香草醛购于上海麦克林公司；高氯酸购于北京化工厂；色谱级乙腈、甲醇购于德国默克公司；常规提取分离用试剂甲醇、乙醇、乙酸乙酯等均为分析纯试剂，购于天津致远化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 不同采收期粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中总皂苷的含量测定

2.1.1 溶液的配制：对照品溶液的制备：精密称取竹节参皂苷Ⅳa 对照品 10.2 mg，置 50 mL 量瓶中，加甲醇使其溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备：称取4~12月采收的粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种粉末各1.0 g，分别置于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇20 mL，70℃超声提取1h（功率250w，频率40 kHz）后过滤，重复提取3次，合并3次滤液，蒸干后用60 %乙醇溶解至25 mL容量瓶中定容，摇匀，即得。

5%香草醛-冰醋酸溶液：取香草醛对照品2.5 g，精密称定，加冰醋酸适量，超声使溶解，转移至50 mL容量瓶中，加冰醋酸定容，保存于4℃冰箱，备用。

2.1.2 显色方法：参考文献［15］方法，分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各 3 份，每份300 L，于 60 ℃水浴挥干后精密加入新配置的 5%香草醛-冰乙酸0.2 mL 和高氯酸 0.8 mL，密塞，摇匀，置 60℃恒温水浴中加热 15 min，取出放入冰水浴中冷却 10 min，加冰乙酸 5 mL，摇匀，在最大吸收波长处进行比色。

2.1.3 测定波长的确定：取对照品溶液和供试品溶液各

3 份，依次按“2.1.2”方法显色，于 400~800 nm 范围内扫

描吸收光谱。

2.1.4 标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液 100、300、 500、700、900、1100 L，各 2 份，置于 10 mL容量瓶中，按“2.1.2”项下方法显色，在 547 nm 处测定吸光度值，以平均吸光度值A 为纵坐标，对照品质量（g）为横坐标进行线性回归计算。

2.1.5 方法学考察：（1）精密度实验：精密吸取 6 份对照品溶液，每份0.3 mL，分别按“2.1.2”项下方法显色，于547 nm 处测量吸光度 A 值，计算 6 次吸光度的 RSD 值。（2）重复性实验：取同批样品 6 份，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1.2”项下方法显色，于 547 nm 处测量吸光度 A 值。（3）稳定性实验：精密吸取“2.1.1”项下供试品溶液，在室温下分别显色后放置 15， 30，45，60，90，120 min，于 547 nm 处测量吸光度 A 值。

（4）加样回收率实验：精确称取已知含量的供试品溶液6份，每份 50 L，分别精密加入竹节参皂苷Ⅳa 对照品溶液 100 L，按“2.1.2”项下方法显色，于 547 nm 处测量吸光度 A 值。

2.1.6 总皂苷含量测定：精密吸取供试品溶液，每份 0.3mL，分别按“2.1.2”项下方法显色，于 547 nm处测量吸光度 A 值，依据线性回归方程计算总皂苷含量。

2.2 不同月份粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中竹节参皂苷Ⅴ和竹节参皂苷Ⅳa 的含量测定

2.2.1 溶液的制备：（1）对照品溶液：精密称取竹节参皂苷Ⅳa 和竹节参皂苷Ⅴ适量，分别稀释成浓度分别为 1.4 mg/mL、1.6 mg/mL 的对照品溶液。（2）混合对照品溶液：精密吸取竹节参皂苷Ⅳa 对照品溶液和竹节参皂苷Ⅴ对照品溶液适量，稀释成浓度分别为 0.28 mg/mL、0.32 mg/ mL 的混合对照品溶液。（3）供试品溶液：称取 4~12 月采收的粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种粉末各 1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入 60 %乙醇 20 mL，70 ℃超声提取 1 h（功率 250 w，频率 40 kHz）后过滤，重复提取 3 次，合并 3 次滤液，蒸干后用 60 %乙醇复溶至 25 mL容量瓶中并定容，摇匀，离心（12000 r/min）5 min 后取上清液过0.45 m 滤膜即得。

2.2.2 色谱条件：参考文献［16］，采用十八烷基键合硅胶色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 m），以乙腈为流动相 A，0.2%磷酸水为流动相 B，流速为 1.0 mL/min，洗脱程序如下040 min，30-32%A；4045 min，32-35%A；4550 min， 35-36%A；5065 min，36%A，色谱柱温度为 35 ℃,样品进样量为 15 L。

2.2.3 方法学考察：（1）系统适用性考察：取“2.2.1”项下制备的对照品、供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，通过对照品的保留时间，进行色谱峰定性，并检测对照品、供试品溶液中色谱峰的分离度、理论塔板数、拖尾因子等系统适用性条件。（2）线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液适量，用甲醇稀释成含竹节参皂苷Ⅴ0.016，0.04，0.08，0.16，0.32 g/mL，含竹节参皂苷Ⅳa 0.014，0.035，0.070，0.140，0.280 g/mL 的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下条件进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。（3）精密度试验：精密吸取 15 L 对照品溶液，按“2.2.2”项下条件连续重复进样 6 次，计算 6 次竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa峰面积的 RSD 值。（4）重复性试验：取同一批粗毛牛膝药材粉末 1.0 g，精密称定，共 6 份，按“2.2.1”项下平行制备 6 份供试品溶液，按“2.2.2”项下条件测定，计算 6 份供试品溶液色谱图中竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 相对保留时间及峰面积的 RSD 值。（5）样品稳定性试验：取“2.2.1”项下的供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“2.2.2”项下条件注入液相色谱仪，计算 6 次进样供试品溶液色谱图中竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 相对保留时间及峰面积的 RSD 值。（6）加样回收率试验：精密称取已知含量的粗毛牛膝粉末 6 份，各 0.5 g，分别按比例加入混合对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率值。

2.2.4 竹节参皂苷Ⅴ和竹节参皂苷Ⅳa 含量测定：取4~12 月份采摘的粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种粉末，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定竹节参皂苷Ⅴ和竹节参皂苷Ⅳa 的峰面积，根据线性方程计算含量。

2.3 UV 法测定总皂苷含量实验结果

2.3.1 波长扫描与线性关系实验结果：对照品溶液和供试品溶液在（547±1）nm 处有最大吸收。竹节参皂苷Ⅳa含量的回归方程为A=0.00416+0.0026（R2=0.9997），表明竹节参皂苷Ⅳa 在 20.4~224.4 g 范围内线性关系良好，设计合理。见图 1、图 2。

2.3.2 方法学考察结果：精密度实验吸光度值分别为

0.218、0.237、0.250、0.234、0.243、0.226，该方法的精密度实验 RSD（n=6）为 4.9 %，表明仪器精密度良好。重复性实验吸光度值分别为 0.734、0.736、0.714、0.738、0.718、 0.717，6 份供试品溶液吸光度A 值的 RSD 值为 1.7%，表明方法重复性良好。稳定性实验吸光度值分别为 0.719、 0.709、0.697、0.683、0.678，2 h 内供试品的稳定性实验RSD 值为 2.5%，表明供试品溶液在2 h 内稳定性良好。实验平均加样回收率为 106.24%，RSD 为 5.0%，表明该测定方法的准确度较高。

2.3.3 总皂苷含量测定结果：粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中总皂苷含量随采摘月份含量无明显规律，牛膝野生种含量均值含量（3.147%）高于粗毛牛膝（2.841%）和柳叶牛膝（2.762%）。见表 1。

2.4 竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 含量测定结果

2.4.1 系统适用性及线性关系考察结果：如图 3 所示，竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 在“2.2.2”项液相条件下，分离度良好。其回归方程、线性范围结果见表 2。

2.4.2 方法学考察：精密度实验 6 次对照品溶液中竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 的峰面积的RSD值分别为1.47%、 1.93%，色谱峰相对保留时间RSD 值为 1.52%、0.65%，表明仪器的精密度良好；重复性实验 6 份供试品溶液中竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 峰面积的 RSD 值分别为 1.31%、1.74%，色谱峰相对保留时间的 RSD 值为 1.83%、 0.71%，表明方法的重复性良好；样品稳定性实验中测得竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 峰面积的RSD值为 1.56%、 0.88%，色谱峰相对保留时间的RSD值为 0.23%、0.13%，表明该测量条件下样品溶液在 24 h 内稳定；加样回收率实验结果见表 3、表 4 所示，竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa的平均回收率分别为 101.59%和 100.96%，RSD 值分别为 1.59%和 1.50%。

2.4.3 不同品种、不同月份土牛膝中竹节参皂苷Ⅴ的含量测定：粗毛牛膝、柳叶牛膝、牛膝野生种中竹节参皂苷Ⅴ的含量随采摘月份含量变化无明显规律，但3 个不同品种之间竹节参皂苷Ⅴ的含量差异较大，牛膝野生种中竹节参皂苷Ⅴ的均值含量（0.176%）明显高于粗毛牛膝（0.076%）和柳叶牛膝（0.033%）。见表 5。

2.4.4 不同品种、不同月份土牛膝中竹节参皂苷Ⅳa 的含量测定：柳叶牛膝、牛膝野生种中竹节参皂苷Ⅳa 含量随采摘月份含量变化较为明显，秋季（810 月）含量较高，范围为0.239%0.364%，且柳叶牛膝中竹节参皂苷Ⅳa 均值含量（0.191%）明显高于牛膝野生种（0.161%）和粗毛牛膝（0. 103%）。见表 6。

3 讨论

目前，中药品种混杂、来源多样的现象在一定程度上制约了中药的研究和发展［17］。就土牛膝而言，各省市地方中药材标准及炮制规范中基原各不相同，如《湖南省中药材质量标准》2009版中定义土牛膝为苋科植物粗毛牛膝的干燥根及根茎［18］，《湖北省中药材质量标准》2018版中土牛膝条目下添加了柳叶牛膝的干燥根及根茎［19］，《江苏省中药饮片炮制规范》1980年版则包含野生牛膝的干燥根和根茎，共3种基源［20］，药材质量标准内容也仅有性状、显微鉴别及齐墩果酸的薄层色谱鉴别，且性状与显微鉴别描述均较简单，并不能对不同基原近似种进行有效区分，但目前并未见有这3种土牛膝中特征皂苷类成分的差异性分析研究［21］。鉴于此背景，本文分析比较了土牛膝不同基源之间特色皂苷类成分含量的差异，结果表明，不同采收月份中的竹节参皂苷Ⅴ含量变化无明显规律性，这可能与野外采收的药材为非同年生有关，柳叶牛膝与牛膝野生种竹节参皂苷Ⅳa含量随季节变化较为明显，于8~10月含量较高，与根类药材最佳采收时间一致，即秋后时期采收，此时根部营养物质储存较多，药效成分含量最高。从药材品种来看，牛膝野生种中总皂苷和竹节参皂苷Ⅴ的均值含量明显高于粗毛牛膝和柳叶牛膝，柳叶牛膝中竹节参皂苷Ⅳa均值含量明显高于牛膝野生种和粗毛牛膝。本研究为土牛膝药材品种基源鉴别及相关中药制剂质量控制提供了一定的科学依据，但深入探讨土牛膝不同基源之间化学成分特征与药效的相关性，尚需做更多物质基础及药理活性系统研究。参考文献：

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