喉咽清口服液微生物限度检查方法的验证

卜生高,王劲争（湖南省永州市药品检验所,零陵 425100）

摘要： 目的 建立喉咽清口服液微生物限度检查方法。方法 接种 5株阳性对照菌,测定其回收率。结果枯草芽孢杆菌采用培养基稀释法回收率为 86％以上；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌、黑曲霉采用常规法回收率为83％以上；控制菌（大肠埃希菌） 采用常规法可检出。结论 经验证喉咽清口服液微生物限度采用培养基稀释法检查细菌；常规法检查霉菌及酵母菌、控制菌。

关键词：喉咽清口服液；微生物限度； 回收率；培养基稀释法； 常规法

中图分类号：R927∙33 文献标识码：A 文章编号： 1002-7777（2009） 12-1210-03

Validation of Microbial Limit Tests of Houyanqing Koufuye

Bu Shenggao and Wang Jinzheng（Institute for Drug Control of Yongzhou City ,Hunan Province ,LingLing 425100）

ABSTRACT： Objective T o set up a method for determining microbial limit s in Houyanqing Koufuye ． Methods The antimicrobial effect of Houyanqing Koufuye w as determined by recovery rate with 5 control strains．Results The recoveries w ere over 86％ w hen culture diluting method w as used with bacillus subtilis ．The recoveries w ere over 83％ w hen routine test method w as used with escherichia coli , staphylococcus aureus ,candida albicans and aspergillus niger．Routine test method can be test for control bacterias（ escherichia coli ）． Conclusions With diluted culture method ,the amount of bacteria can be determined in Houyanqing Koufuye , also with conventional method , molds and soccharmyces and controled bacteria can be determined．

KEY WORDS： Houyanqing Koufuye；microbial limit ；recovery rate；culture diluting method；routine test method

喉咽清口服液主要由土牛膝、马兰草、车前草、天名精等中药组成,辅料为蔗糖、防腐剂（苯甲酸钠）,具有清热解毒、利咽止痛的作用。根据《中国药典》 2005年版（一部）微生物限度检查法规定,在建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证, 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。笔者参考有关资料［1-10］,探讨了喉咽清口服液微生物限度检查方法的验证,现报道如下。

1 材料

喉 咽 清 口服 液（ 规 格： 每 支 10mL , 批号： 20070702,湖南时代阳光制药有限公司）。

LRH-150B 、LRH-250A 生化培养箱（广东省医疗器械厂）。

营养琼脂培养基（批号： 061201）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号： 060509）、营养肉汤培养基（ 批 号： 060823）、 改 良 马 丁 培 养 基（ 批 号： 070514）、 胆 盐 乳 糖 培 养 基（ 批 号： 061014）、 MUG 培养基（批号： 060425） （培养基均符合《中国药典》 规定的干燥培养基,北京三药科技开发公司）。

pH7∙0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（每瓶 250g ,北京三药科技开发公司,批号 061102）； 0∙1％无菌蛋白胨水溶液。

大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC （B）(c)l994-2023 china Academic Journal Electronic pubolishing House · Al rights reserved. http:Ww. cnki.net44102］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ［CMCC（B ） 26003］、 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis ）［CMCC（B）63501］、 白 色 念 珠 菌（Candida albicans）［CMCC （F ） 98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F） 98003］（中国医学细菌保藏中心）。

2 实验方法

2.1 菌液的制备

2.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中9置30～35℃培养 18～24h 9分别取上述培养物 1mL 9加0∙9％的无菌氯化钠溶液 9mL 9 10倍递增稀释制成每 1mL 含菌数为 50～100cfu 的菌悬液。

2.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中9置23～28℃培养 24～48h 9取上述培养物1mL 9加0∙9％的无菌氯化钠溶液 9mL 910倍递增稀释制成每 1mL 含菌数为50～100cfu 的菌悬液。

2.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基 中9置 23～ 28℃ 培养 5～ 7 天。 用0∙9％的无菌氯化钠溶液5mL 将孢子洗脱并过滤孢子悬液至无菌试管内9用 0∙9％的无菌氯化钠溶液稀释制成每 1mL 含孢子数为50～100cfu 的孢子悬液。

上述各株菌的培养物均为第 3代的培养物。

2.2 供试液的制备

取本品 10mL 9加 pH 7∙0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 90mL 9摇匀9制成 1 ∶ 10的供试液。

2.3 菌落计算方法的验证

2.3.1 常规法 ①试验组（A 组）：取 1 ∶ 10供试液 1mL 9分别加入10个平皿中9再依次加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌、 黑 曲霉 5 种 菌 的 菌悬 液 1mL （含 50~ 100cfu）9每株菌平行制备 2个平皿9立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基）9分别置 30～35℃培养48h 和23～28℃培养 72h 。②菌液组（B 组）： 分别取上述稀释的菌液 1mL 注入平皿内9每个菌平行制备 2个平皿9测定所加的试验菌数。③供试品对照组（C 组）：分别取 1 ∶ 10供试液 1mL 9注入10个平皿中9立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基9每种培养基制备 2个平皿9分别置30～35℃培养 48h 和23～28℃培养72h 。 以测定供试品的本底菌数。④稀释剂对照组（D 组）： 除用1mL pH 7∙0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液替代 1 ∶ 10供试液外9其余同试验组。⑤上述方法平行实验3次

由表1可见常规法3次试验中9大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌、黑曲霉的回收率均达70％以上9但枯草芽孢杆菌试验组菌的回收率未达70％以上。说明常规法适合于该品种的霉菌及酵母菌计数9但不适合于本品的细菌计数。

2.3.2 培养基稀释法 ①试验组（A 组）：取 1 ∶ 10供试液 1mL 分别加入 5 个平皿中（每个平皿0∙2mL）9每皿加入含 50～100cfu 的枯草芽孢杆菌菌悬液 1mL 9每法平行制备 2组数据。立刻倾注营养琼脂培养基9置30～35℃培养 48h 。②菌液组（B 组）：分别取上述稀释的菌液 1mL 注入平皿内9每个菌平行制备 2个平皿9测定所加的试验菌数。

③供试品对照组（C 组）：取 1 ∶ 10供试液 1mL 分别加入5个平皿中（每个平皿0∙2mL）9每法平行制备2组数据9立刻倾注营养琼脂培养基9置 30 ~ 35℃培养 48h 。④ 稀释剂对照组（D 组）： 除用1mL pH 7∙0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液替代 1 ∶ 10供试液外9其余同试验组。⑤上述方法平行实验 3次。结果见表 2。

由表 2可知9用培养基稀释法（每皿0∙2mL）对喉咽清口服液进行细菌回收率的测定93次试验结果各菌的回收率均达70％以上（《中国药典》 要求回收率应不低于70％）9说明培养基稀释法（每皿0.2mL） 适合于该品种的菌落计数。

2.4 控制菌（大肠埃希菌）检查方法的验证

2.4.1 试验组 取 1 ∶ 10供试液 10mL 9加入含50～100cfu 的大肠埃希菌菌悬液 1mL 9置 100mL的胆盐乳糖增菌培养基内935℃ ~ 37℃培养 24h 。取上述培养物 0.2mL 接种至 5mL MUG 培养基的试管内935℃ ~ 37℃培养 5924h 9在 366nm 紫外线下观察有荧光反应9滴加靛基质试液9液面呈玫瑰红色。

2.4.2 阴性菌对照组 取 1 ∶ 10供试液 10mL 9加入含 50～100cfu 的金黄色葡萄球菌菌悬液 1mL 9置 100mL 的胆盐乳糖增菌培养基内935℃ ~ 37℃培养24h 。取上述培养物 0.2mL 接种至5mL MUG培养基 的试管 内9 35℃ ~ 37℃ 培养 59 24h 9 在366nm 紫外线下观察无荧光反应9滴加靛基质试液9液面呈试剂本色。

上述验证结果表明试验组检出了大肠埃希菌而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。说明可采用常规法对本品进行控制菌（大肠埃希菌）检查。

3 结论

综上所述9该品种微生物限度检查方法为：取本品 10mL 9加 pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液90mL 9制成 1 ∶10供试液。采用常规法进行霉菌及酵母菌数测定和控制菌（大肠埃希菌）检查；采用培养基稀释法（每皿0.2mL）进行菌落数测定。

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