【标准溶液的配制】

胭脂红酸标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取100.0mg（精确至0.1mg）标准品，用水溶解，并定容至100mL容量瓶中，摇匀，于4℃下避光保存，有效期3个月。

标准系列工作液：分别准确吸取标准储备液(1.0mg/mL):0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL于10mL容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L和100mg/L标准系列工作液。临用时配制。

【试液配制】

盐酸溶液(2.0mol/L)：量取168mL盐酸至盛有800mL水的1000mL容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用水定容至刻度，混匀即得。

2%磷酸甲醇溶液：吸取2mL磷酸至盛有80mL甲醇的100mL容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用甲醇定容至刻度。

0.1%磷酸水溶液：量取1.0ml磷酸，加水定容至1000ml，混匀即得。

0.1%磷酸乙腈溶液：吸取1.0mL磷酸至盛有800mL乙腈的1000mL容量瓶中，充分混匀，冷却至室温，用乙腈定容至刻度。

【样品提取】  

1.液体、半固体试样（含乳半固体除外）

称取风味发酵乳2g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，加入盐酸溶液（2.0mol/L）40mL，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温后，振荡5min，超声5min，5000r/min离心5min，上清液转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，从中准确移取25mL样液做为待净化液。

2.固体、含乳半固体试样（调制乳粉除外）

称取巧克力2g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，加入盐酸溶液（2.0mol/L）40mL，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温后，振荡5min，超声5min，10000r/min离心10min，上清液转移至100mL容量瓶中，残渣加入盐酸溶液（2.0mol/L），常温下，重复提取1次，合并2次提取液，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，从中准确移取25mL样液做为待净化液。

3.调制乳粉

称取2g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，加入盐酸溶液（2.0mol/L）40mL，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温后，振荡5min，超声5min，10000r/min离心10min，上清液转移至250mL容量瓶中，残渣加入盐酸溶液（2.0mol/L）40mL，常温下，重复提取2次，合并3次提取液，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，从中准确移取25mL样液做为待净化液。

【净化】   HPSW   MAX 固相萃取柱 (150mg/6ml)

（1）活化：依次用6mL甲醇、6mL水

（2）上样淋洗：将25mL待净化液过柱，弃去流出液，依次用12ml水和6ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，真空抽至柱体近干。

（3）洗脱：用6 mL 2%磷酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于40℃水浴下氮吹浓缩至近干，用磷酸水溶液（0.1%）定容至2mL，涡旋混匀1min，3000r/min离心5min，上清液过0.22μm亲水PTFE滤膜，上机。

【参考仪器条件】

仪器：液相色谱Shimadzu LC-16

色谱柱：HPSW AQ-C18(150mm×4.6mm,5μm)

检测器：紫外

检测波长：494nm

流速：1.2ml/min

 进样体积：10μL 

柱温：40℃

洗脱条件：

【实验结果】加标水平浓度：0.04g/kg（20μg/mL）

基质加标回收率数据

图1-标准溶液图

图2-风味发酵乳加标图

图3-风味发酵乳样品图

图4-巧克力加标图

【注】

①有些样品处理后用脱脂棉过滤后还是很浑浊，导致上样流速变慢，可以使用定量滤纸过滤，使上样液澄清。

②尼龙滤膜会对胭脂虫红有吸附，建议用PTFE亲水滤膜。

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