应用分享｜食品中对羟基苯甲酸酯类化合物的测定

【标准溶液的配制】

1.单个对羟基苯甲酸酯类化合物标准储备液（1.00 mg/ml）：分别准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基茶甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸庚酯标准品各 0.05 g（精确至 0.0001g），甲醇溶解并定容至50.0 ml，4℃下保存，有效期为6个月。

2.对羟基苯甲酸酯类化合物混合标准中间液（100μg/ml）：准确吸取各对羟基苯甲酸脂类化合物标准储备液1.0ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，4℃下保存，有效期为3个月。

3.对羟基苯甲酸酯类化合物混合标准工作液：分别吸取对羟基苯甲酸酯类标准中间液0.02ml、0.05ml、0.10 mL、0.20ml、0.50ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml于10 ml容量瓶中，用甲醇-水溶液(3+7)定容，的质量浓度分别为0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的混合标准工作液，临用时配制。

【试液配制】

甲醇-水溶液(3+7)：量取100ml甲醇和400ml水，混匀即得。

甲醇-水溶液(3+7)：量取150ml甲醇和350ml水，混匀即得。

0.1%磷酸水溶液：量取1.0ml磷酸，加水定容至1000ml，混匀即得。

2%甲酸甲醇溶液：量取2.0ml甲酸，甲醇定容至100ml，混匀即得。

【样品提取】  

1.鲜水果、新鲜蔬菜、酱油等:

称取样品5g（精确至0.01 g）于50ml刻度离心管内，加水5ml，涡旋3min，加入甲醇10ml，涡旋3min，超声20min，6000r/min离心3min，取全部上清液于另一50ml刻度离心管中，残渣中再加入甲醇-水溶液（2+8）10ml重复提取1次，合并两次提取液，加水至40ml，6000r/min离心3min，取全部上清液，待净化。

2.碳酸饮料、风味饮料、果蔬汁等：

分别称取5 g（精确至0.01 g）可乐、风味饮料于50 mL刻度离心管内（碳酸饮料需在超声波清洗器中超声脱气10 min再称样），加入甲醇-水溶液（3+7）30 mL，涡旋3 min，超声20 min，再加入甲醇-水溶液（3+7）至40 mL，6000 r/min离心3 min，过滤上清液，取滤液，待净化。

3.果酱和热凝固蛋制品等：

称取草莓果酱5g于50mL刻度离心管中，加入1mL浓氨水和4mL水，涡旋3min，放置1h，加入甲醇10mL，涡旋3min，超声20min，8000r/min 离心3min。取全部上清液于另一50mL刻度离心管中，残渣中再加入甲醇-水（2+8）10mL重复提取1次，合并两次提取液，加水至40mL，8000r/min离心3min，取全部上清液，待净化。

【净化】   HPSW   MAX 固相萃取柱 (500mg/6ml)

（1）活化：依次用5mL甲醇、5 mL水

（2）上样淋洗：将待净化液全部过柱，弃去流出液，依次用5ml水和5ml甲醇-水溶液（3+7）淋洗，弃去淋洗液。

（3）洗脱：用7 mL甲醇洗脱（热凝固蛋制品和果酱用6 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱），收集洗脱液，加水定容至10 mL，过滤膜，供高效液相色谱仪测定。

【参考仪器条件】

仪器：液相色谱Shimadzu LC-16

色谱柱：HPSW AQ-C18(150mm×4.6mm,5μm)

检测器：紫外

检测波长：254nm

流速：1ml/min

进样体积：10μL 

柱温：35℃

洗脱条件：

【实验结果】

加标水平浓度：2mg/kg（1μg/mL）

基质加标回收率数据

图1-标准溶液图

图2-可乐加标图

图3-可乐样品图

图4-风味饮料加标图

图6-草莓酱加标图

【注】

①果酱基质中含有较多果胶、多糖和有机酸，标准中加入5mL浓氨水。氨水浓度太高的情况下，果酱中的果胶和多糖会发生皂化和水解，使得样液粘度变大易造成MAX 小柱发生堵塞，流速慢。实验室优化氨水浓度后，在既能中和果酱中的有机酸的前提下，同时降低了样液的粘稠度，使得后续净化过程更加顺利。

②用6ml甲醇洗脱对羟基苯甲酸庚酯回收不好时，改为用7ml甲醇或者6ml  2%甲酸甲醇溶液洗脱，对羟基苯甲酸酯类化合物是弱酸性，用2%甲酸甲醇洗脱酸性目标物效果更好。

③热凝固蛋白和果酱样品提取液过柱滴速可能较慢，可以适当加压，以提高过柱速度，但要控制滴速不超过1滴/s。

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