代谢组学：维生素D3加强对虾肠道免疫中的抗菌反应
海产品是动物蛋白的重要来源，海产品中白肉相对于大部分陆生家畜的红肉更为优质，因此，全球对海产品的需求正逐步增加。然而，频繁爆发的病原菌感染的水产品给世界各地的水产养殖业造成了重大损失，因为病原菌引起的疾病降低了水产品质量，导致鱼类、软体动物、虾类等水产养殖动物大量死亡。疾病的爆发限制了水产食物的供应。在虾类养殖中，病害主要由病毒、细菌、真菌和寄生虫等病原体引起，约20%的病害损失可归因于细菌病原。对虾的病原菌中，副溶血性弧菌和立克次体感染最为严重。
副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性细菌，通常存在于港口、海岸和海洋环境中。副溶血性弧菌由Fujino Tsunesaburo在1950年的一次食物中毒暴发中首次分离得到，是水产动物(包括鱼、虾和贝类)的主要病原体。
目前，对弧菌引起的肠道疾病的控制主要依靠抗生素，但是，这除了破坏微生物成熟系统外，使用抗生素治疗发光弧菌(与副溶血性弧菌密切相关的细菌)引起的疾病是并没有效果。因此，急需有效的抗生素替代品来控制养殖水中细菌疾病，特别是弧菌病的暴发。
近年来，高通量实验技术，也就是著名的“组学技术”（包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学），已经发展成为了诊断疾病、生物标志物筛选、发病机理研究等领域卓有成效的技术手段，代谢组学可以从生物样本中检测到小分子的代谢物，相比于转录组学和蛋白组学，代谢组学可以更精准的反应生物体的表现型，能揭示外部刺激或病理变化时的代谢反应。迄今为止，在副溶血性弧菌感染后对虾肠道内容物代谢组学的研究尚未见报道。对虾肠道菌群对于宿主的健康以及发病机理有着重要作用，这些肠道菌群数量繁多，在代谢过程中发挥着重要作用，肠道菌群驱使的代谢能够调节宿主的代谢。因此，鉴别对虾肠道中代谢产物变化对研究肠道免疫来说，似乎越发重要。
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对于对虾肠道微生物代谢组学的研究，山东大学动物细胞与发育生物学重点实验室目前发布了他们的科研成果：
1.使用非靶向代谢组学分析鉴定不同的代谢物
为了鉴定可能会对肠道菌群稳态有重要作用的代谢物,使用液相色谱-质谱联用法分析对虾在口服副溶血弧菌后的肠道的内容物，分析鉴定出69种不同丰度的代谢产物。
在这些不同丰度的代谢产物中，VD3以及其下游代谢产物数量变化明显，引人注目。因为VD3有免疫相关功能，因此选取VD3做进一步的研究。副溶血性弧菌侵染后，对虾肠道内类固醇生物合成代谢途径维生素的D3含量显著下降，同时，VD3的下游代谢产物含量显著提高。上述结果表明，副溶血弧菌攻毒能促进对虾肠道内维生素D3的代谢，而类固醇的生物合成代谢与细菌侵食后对虾肠道内微生物的稳态有关。
维生素D3在对虾肠道微生物稳态中起重要作用
通过存活率试验验证维生素D3在虾体内的作用。从图A可以看出，投喂维生素D3饲料的对虾感染副溶血性弧菌后，存活率得到了有效提高。为了探讨维生素D3对虾存活率的影响，对虾消化道副溶血性弧菌的数量进行分析。从图B可以看出，添加维生素D3的虾的胃和肠道细菌数量明显少于添加缓冲液PBS的虾。这表明维生素D3与对虾致病菌副溶血弧菌的侵袭有关，并有利于受感染的对虾的生存。
图(A) 补充维生素D3感染副溶血性弧菌对虾的存活率。将虾分为添加维生素D3和添加PBS两组(每组35只虾)。每日监测副溶血性弧菌口服感染后虾的生存情况。
图(B) 补充维生素D3 24 h后，通过口服副溶血弧菌感染。感染6 h后，收集肠道内容物，用PBS稀释，在LB平板上培养过夜。计数副溶血性弧菌菌落数量。
进行实时荧光定量PCR（qPCR）检测某些抗菌肽基因在肠道和胃中的相对表达量。从图4C、D可以看出，维生素D3显著诱导了副溶血菌攻击后抗菌肽基因（mjif - a2、mjif - d1、mjif - e1、MjCrus I-2、MjCrus I-3、MjCrus I-5）在肠道和胃中的表达。
图(C).补充维生素D3后虾肠内AMP基因的表达水平。补充维生素D3 24 h后，通过口服副溶血弧菌攻毒。以β-肌动蛋白基因为内参，采用qPCR法测定几种抗菌肽在虾肠中的mRNA表达水平。补充PBS作为对照
图(D) 补充维生素D3后虾胃中AMP基因的表达水平。补充维生素D3 24 h后，通过口服副溶血弧菌攻毒。以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参，采用qPCR法测定虾胃中几种AMPs的mRNA表达水平。补充PBS作为对照。
通过这一代谢组学分析，我们发现维生素D3参与了虾感染副溶血性弧菌期间的肠道免疫。
转录组学分析
实时荧光定量PCR(qPCR)分析表明，在没有外部细菌攻毒的情况下，维生素D3可以诱导某些抗菌肽基因（包括MjCrus I-2和MjCrus I-3）在对虾肠道中表达。
当对虾从口腔感染副溶血弧菌时，维生素D3将迅速代谢成它的活跃形式（1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 ），激活酚氧化酶原系统和Toll免疫信号通路，在消化道中诱导某些抗菌肽的表达，抑制细菌繁殖以维持微生物的稳态。
维生素作为生物体代谢中酶和辅酶的组成成分，生物体代谢中的信号灯和交通警察，使体内的各种代谢更加的顺畅。
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（文章转自：浙江正大水产）
