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转载：笑看风云5亿载 · 默默奉献半世纪 ——记鲎和鲎试剂细菌内毒素检测

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2022-04-02

导读：内毒素检测，选Lonza就对了。四种检测方法可选，配套整体解决方案，国际认可，行业金标准。

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对，没错，我们这次是讲鲎（h-òu），不是h-ōu，更不是鳖（biē）。

硬硬的壳，尖尖的尾，四只眼，似蟹而非蟹，如同马蹄，人称“马蹄蟹”。拉丁名Limulidae，英文名Horseshoe Crab，别名夫妻鱼。

【“马蹄蟹”牌扫地机器人】

最早的鲎化石发现于奥陶纪（5.05~4.38亿年前），到志留纪时（4亿多年前）海洋无脊椎动物发生了重要的更新，繁盛一时的三叶虫逐渐衰退，板足鲎类开始兴起，这就是现代鲎的祖先。4亿年后，鲎没有发生太大变化，几乎只是玩了一把“穿越”。现代鲎没有近亲，与蜘蛛、蝎子同门，仅有4个物种：美洲鲎、中国鲎、巨鲎、圆尾鲎。

图1. 志留纪板足鲎复原图和现代鲎分类学地位 [1]

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在我国，关于鲎的记载由来已久。

『 山海經註：鱟魚形如惠文冠，靑黑色，十二足，長五六尺，似蟹，雌常負雄，漁子取之，必得其雙。子如麻子，南人爲醬。』

那“鲎”名有啥来源？

据说在南方一些方言中，鲎和“学”字同音，所以应该是“学”表音，“鱼”表意。这样说来，鲎还是“一种有学问的鱼”了。的确，笑看风云5亿年，这种生物的存在的确蕴含着独特的生存智慧。

几亿年间，地球上因为内部和外部的环境变化，一共经历过5次生物大灭绝（6500万年前白垩纪~4.4亿年前奥陶纪晚期，行星撞击和全球气温变化，导致约70%~90%的生物毁灭），而鲎以它坚强的意志力、无与伦比的适应能力，保全了自己，活到现在，且容颜未改，纯属奇迹！

图2. 鲎化石及化石复原图及现代鲎血液系统[2]-左：2021年重庆秀山，恐鲎生态复原图，距今4.3亿年[3]；中：2007年云南罗平，罗平鲎，距今2.4亿年[4]；右：鲎血液循环系统【点击看大图】

至于奇迹发生的原因，大致如下：身上长有坚硬的“盔甲”，可以防身；自然界中鲎也没什么天敌，具有毒性一般不被人食用；繁殖能力很强，一次产卵200粒以上；三种栖息地（沙滩，低潮位泥质滩涂，海域）依次渡过，避免大鲎和小鲎争抢食物地盘，分散了竞争的压力；除此之外，还有一个主要原因在于鲎抗菌能力。万物都终将止于细菌，但鲎利用身体机能抵抗细菌，自然能够存活和保全。

鲎跟人类一样，也需要氧气，但运载氧气的是含铜离子的血蓝蛋白，因此鲎血呈现出淡蓝色，“蓝血生物”就此得名。

鲎血最神奇的地方并不在于颜色，而是其独一无二的抗菌能力。鲎最喜欢呆的海边是一个极其肮脏的地方，但鲎却不像人类一样拥有层层防疫屏障。其血液循环系统是一个相对敞开的格局，所以细菌只要在鲎壳的某条缝中钻入，它就能轻松地在鲎的体内畅通无阻地遨游。鲎也没有可以对抗感染的白细胞，为了不让自身被细菌吞噬，鲎的血液也演化出了有别于人类的保护机制：一种流动性阿米巴样细胞，与细菌接触时不会像白细胞那样将细菌吞噬，反而是立即萎缩破裂释放出来的化学物质，便会使血液局部凝固，形成血栓包住有害的细菌，阻断疾病的传播。庞博士（Frederic Bang）在1956年研究鲎的血液循环时，和助手小杰（Jack Levin）发现细菌产生的内毒素导致的凝血机理[5]，并开发出了一种的细菌检测剂——鲎试剂（LAL，Limulus Amebocyte Lysate，鲎阿米巴样细胞裂解物）。

图3.内毒素检测原理发现

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在医学上，鲎的珍贵蓝色血液价值极大，但是这个价值在20世纪中庞博士的重大发现之后才被利用。此后几十年中，鲎试剂被广泛用于内毒素检测，并逐步被收载于药典。

图4. 鲎试剂内毒素检测发展史

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2003年，Jeak Ling Ding等酵母重组表达C因子[6]，Lonza公司得到了该生产工艺的授权，并商业化了产品PyroGene重组C因子内毒素检测试剂盒，用于鲎试剂内毒素检测方法的有力补充。

内毒素在自然界中无处不在，也是肠外药品中最常见和最危险的热原之一，通常指革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）成分。LPS进入人体血液后，会导致内毒素毒性效应，包括发热、腹泻、呕吐，以及致命的内毒素休克。

在制药行业，特别是注射用药，对细菌内毒素进行可靠和有效的检测是重要环节。标记为无热原或无菌的注射或植入产品必须进行内毒素检测放行。许多原材料检查也必须进行内毒素检测方能用于GMP生产，以达到设计标准的质量要求。

根据鲎血来源不同，一般分为LAL（美洲鲎试剂）/TAL（东方鲎鲎试剂），鲎试剂检测法是一种可靠、灵敏、特异性强的内毒素检测方法，也是监管机构主要的推荐方法，应用广泛。微量的内毒素也能触发这种免疫反应，通过一个复杂的凝血级联反应，从而形成血栓（凝胶），从而对样品中是否存在内毒素进行定性/定量评估。

根据鲎试验反应原理，目前行业内已经建立了四种主要的细菌内毒素检测方法：凝胶法、比浊法、显色法和rFC法，并在非肠道药物和注射器械生产过程控制和产品放行质控检测中有着重要的应用。比浊法、显色法和rFC法是定量方法，凝胶法为定性或者半定量方法。鲎试剂检测级联反应和具体方法原理如下图。我们在后期文章里面会仔细讲解和分析每一种内毒素检测方法，在此不做太多展开。

图5. 内毒素检测原理及方法

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Lonza（龙沙）内毒素产品于1970年代面世，半个世纪以来，为全球客户提供包括细菌内毒素检测试剂盒、内毒素检测软件、全自动内毒素检测仪器在内的一站式解决方案，符合FDA 21 CFR part 11和欧盟EU GMP 附录11法规要求，以服务于各类细胞制剂生产企业、制药企业质控部门，可植入医疗设备和透析样品质控以及科研院所等相关机构，其服务对象覆盖70%的制药100强企业，已用于国外大量药物的放行上市，满足出口型制药企业的规模化热源测定需求。

产品包括：LAL血液来源的用于定量检测的动态显色法鲎试剂试剂盒，动态浊度法鲎试剂试剂盒，终点显色法鲎试剂试剂盒，凝胶法鲎试剂试剂盒以及不依赖于鲎试剂的重组C因子检测试剂盒，美洲鲎鲎试剂可以实现产品的稳定供应。

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行业金标准
国际认可，双报优势（中欧、中美）
不同检测方法及产品可选（4种方法）
检测解决方案（试剂盒、仪器、软件、耗材）
可自动化（浊度法、显色法、rFC方法）
长时间使用经验积累和口碑基础
仪器软件兼容性广，适合大多数用户

下一期，我们来重点看看内毒素到底是个啥吧。欢迎持续关注。

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参考文献：

[1]鲎，这个星球上的神奇物种!

[2]Krisfalusi-Gannon et al. The Role of Horseshoe Crabs in the Biomedical Industry and Recent Trends Impacting Species Sustainability. Frontiers in Marine Science, 2018, 5, 185.

[3]我国科学家发现4.3亿年前的“海蝎子”,新华网 2021.10.04

[4]罗平生物群.成都地质调查研究所.

[5]Bang FB. A bacterial disease of Limulus polyphemus. Bull Johns Hopkins Hosp. 1956 May;98(5):325-51.

[6]Ding,Jeak Ling, Ho,Bow(2003-11-11). Assays for endotoxin. ScholarBank@NUS Repository.

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