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在过去十年中，嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞疗法已成为一种有潜力的抗癌免疫疗法。CAR-T细胞在细胞表面表达合成受体，通过识别特定的肿瘤抗原来检测和根除癌细胞。与T细胞不同，CAR-T细胞可以在没有人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的情况下识别癌细胞表面的抗原。因此，CAR-T细胞可以区分比天然T细胞更广泛的靶标。当CAR-T细胞与靶抗原结合时，它们被激活并充当攻击肿瘤的“活性药物”。
目前，在白血病（ALL）、骨髓瘤（myeloma）和非霍奇金 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）等血液系统恶性肿瘤中，过继性 CAR-T 细胞疗法在治疗化疗难治性患者中显示出疗效。
自2017年以来，已有六种CAR-T细胞疗法被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于血液系统癌症。Kymriah（tisagenlecleucel）和Yescarta（axicabtagene ciloleucel）是首个获批的CAR-T产品，分别用于治疗ALL患者和DLBCL成人患者。在此之后，更多的CAR-T细胞治疗获得批准。总的来说，六种CAR-T细胞产品中有四种是抗CD19 CARs，两种最新的CAR-T细胞产品则靶向B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）。
然而CAR-T细胞疗法在实体瘤中的作用价值仍然没有定论，并且受到障碍限制，包括有限的肿瘤运输和浸润，免疫抑制肿瘤微环境的存在以及与这种治疗相关的不良事件。
最近，CAR-Natural Killer（CAR-NK）和CAR-巨噬细胞（CAR-M）被引入作为实体瘤CAR-T细胞疗法的补充或替代品。CAR-NK细胞不需要人白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen，HLA）相容性并且毒性有限，并且可从多个来源大规模产生，因此是CAR-T细胞的有利替代品。此外，目前正在研究CAR-M免疫疗法的吞噬作用、肿瘤抗原呈递和广泛的肿瘤浸润能力，有望在实体瘤治疗中取得进步。
那么，最近CAR-T细胞疗法有什么新进展？其他CAR细胞疗法是否有新突破？让我们来了解一下！
1. 迭代更新
CAR-T疗法的积极反馈带来持续研究，科研人员试图改善CAR-T活性，同时最大限度减少毒性。目前，有四代CAR-T已被开发或正在开发中。第一代CAR的设计很简单，它们仅在细胞内区域包含一个活化结构域（CD3ζ链），CD3ζ的这种简单结构具有有限的治疗活性，该结构可以发送导致T细胞活化的信号。然而，它不支持细胞扩增，但这却是疾病控制的必要步骤。为了克服这个问题，第二代CAR-T具有共刺激信号结构域（例如CD28，4-1BB和OX40），该结构域被添加到细胞内区域，导致双信号配置，产生显著的细胞扩增和活性提高。第三代CAR是在第二代的基础上开发的，除了细胞内区域的活化结构域CD3ζ链外，它还具有两个共刺激结构域，从而增强了CAR-T细胞的存活率。随后，第四代CAR-T细胞被开发出来，它们被称为T细胞重定向用于抗原无限制性细胞因子启动的杀伤（TRUCKs）。通过引入导致诱导性细胞因子（如IL-12）产生的其他转基因来修饰它们，除了可以调节肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）外，还改善了细胞功能。
2. 难题困扰
CAR-T细胞疗法目前面临几大难题，包括疗效、安全性和实体肿瘤困境，对 CAR-T 细胞初始反应后的复发仍然是一个主要问题。CAR-T治疗后复发的患者分为两大类：抗原阳性复发和抗原阴性复发。当对 CAR-T 治疗的反应不足时，会发生抗原阳性复发，此类复发与人体中CAR-T细胞持久性差和增殖有关。抗原阴性复发是由抗原逃逸导致的，这可能是由基因突变引起。其次，细胞因子释放的程度反映了T细胞活化的程度，这对于达到足够的临床效果至关重要。然而，它也是免疫相关不良事件（irAEs）的原因，其中包括CRS和神经毒性。因此，预防细胞因子相关毒性的策略是降低T细胞活性或阻断细胞因子效应。克服以上两个问题有新的策略，主要包括与其他疗法联合使用，以及开发新型CAR-T设计。
此外，虽然实体瘤是所有癌症中数量最多的，但CAR-T细胞疗法仍然不适用于实体瘤。这种疗法在实体瘤的治疗中存在几个障碍，包括抗原特异性/异质性、细胞运输不良和免疫抑制TME。
3. 下一代CAR细胞
尽管CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大成功，但其毒性和上述其他局限性显着阻碍了患者获得及其在实体瘤治疗中的扩展。鉴于这些缺陷，人们越来越有兴趣和大量研究寻找CAR细胞治疗的替代效应细胞。NK细胞和巨噬细胞是制造下一代CAR的两个有希望的候选者，因为它们具有良好的特性。与T细胞不同，它们是先天免疫系统的成员，可以直接识别没有MHC的靶细胞，并且不引起移植物抗宿主病（GVHD）。
与CAR-T细胞相比，NK细胞有几个优点，其中之一是即使MHC分子下调，它们也能识别肿瘤细胞，并允许它们避免抗原逃逸。此外，NK细胞可以从各种同种异体来源中提取，例如诱导多能干细胞（iPSCs）或脐带血。CAR-NKs的抗肿瘤活性已在各种血液学和实体瘤的临床前模型中得到证实。此外，一项I/II期临床研究纳入了11例CD-19阳性血液系统恶性肿瘤患者，结果发现给予同种异体CAR-NK细胞后未见显著毒性报道。
巨噬细胞代表了另一个具有独特特征的有前途的候选者。首先，它们可以通过选择性吞噬作用攻击肿瘤细胞，并将抗原呈递给T细胞以进行适应性免疫激活。其次，巨噬细胞是肿瘤微环境中最充分、浸润程度最高的先天细胞。最后，它们可以产生趋化因子或细胞因子，从而作为主要的免疫调节剂来重塑抑制性TME。在临床前研究中，CAR-M细胞成功地在体外破坏了癌细胞，并减少了具有两种不同实体瘤的小鼠模型中的肿瘤负荷，从而改善了总生存期（Overall Survival，OS）。其他研究表明，CAR-M细胞促进促炎细胞因子的分泌，增强T细胞对肿瘤的细胞毒性活性。
1. 应用于（非）病毒性上皮癌
工程化T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中显示出高反应率和频繁的完全反应，并有望治疗广泛的癌症。在治疗实体瘤的进展中，用T细胞受体（TCR）-T细胞靶向E7抗原导致治疗难治性癌症（包括宫颈癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌）展示了稳健肿瘤消退。此外，claudin18.2（CLDN18.2）-CAR-T细胞最近被报道在胃癌中显示出可控的毒性和临床活性，这些研究和其他研究的经验教训正在指导工程T细胞疗法的扩展应用和下一代技术的发展。
《Cancer Cell》重点回顾了基因工程T细胞和临床研究阐明的原理，用于开发细胞和基因疗法从而治疗病毒性和非病毒性上皮癌，并讨论了上皮癌细胞治疗的最新进展和未来方向，将研究过去的经验如何指导未来的治疗和生物标志物发现战略。
2. KTE-X19在套细胞淋巴瘤患者中的三年随访结果
尽管套细胞淋巴瘤（MCL）的治疗最近取得了进展，但大多数治疗提供的反应持续时间有限，表明对新疗法的需求尚未得到满足。MCL预后取决于MCL危险因素，具有这些特征的患者治疗选择有限且结局不佳，初始治疗后中位总生存期（OS）为6.6个月至4年。此外，先前的治疗可能会影响后续治疗的结果。ZUMA-2（ClinicalTrials.gov 标识符：NCT02601313）是一项关键的单臂多中心II期试验，Brexucabtagene autoleucel（KTE-X19）自体抗CD19 CAR-T 细胞疗法被批准用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤（MCL）。
《Journal of Clinical Oncology》上的一篇文章，在KTE-X19复发/难治性MCL的关键性ZUMA-2研究中，报告了3年随访后的结果。中位随访35.6个月后，所有68例治疗患者的客观缓解率为91%，68%完全缓解；缓解持续时间、无进展生存期和总生存期的中位数分别为 28.2个月、25.8个月和 46.6个月。在一项探索性分析中，既往接受过苯达莫司汀的患者受益于KTE-X19，但表现出T细胞功能减弱的趋势，在白细胞去除术后6个月（而不是12个月）内给予苯达莫司汀的影响更大。迟发毒性很少见；只有3%的ZUMA-2治疗中出现的不良事件发生在较长的随访期内。
这些数据是迄今为止MCL患者中CAR-T细胞治疗最长的随访时间，表明KTE-X19在复发/难治性MCL患者中诱导持久的长期反应，安全性可控，也可能使具有高风险特征的患者受益。
3. 克服CAR-T细胞疗法对实体瘤的靶向、肿瘤外毒性
CAR-T细胞疗法为实体瘤患者的治疗带来了各种挑战，包括由于CAR-T细胞介导的对表达靶抗原的非恶性组织的细胞毒性，而导致临床上严重的靶向、肿瘤外毒性（on-target, off-tumour toxicity，OTOT）的风险。事实上，在涉及实体瘤患者的各种CAR-T细胞临床试验中已经观察到严重的OTOT，建立预测、减轻和控制这种效应发作的策略十分重要。
《Nature Reviews Clinical Oncology》的一篇综述，总结了CAR-T细胞联合OTOT治疗实体瘤的当前临床证据，并讨论了临床前小鼠模型在预测临床OTOT中的实用性，描述了正在开发的新策略，特别是靶结合剂亲和力调整、逻辑电路和合成生物学的作用，以提高CAR-T细胞在实体瘤中的特异性。此外，该综述强调了可用于减轻细胞输注后临床OTOT的控制策略，例如调节或消除CAR-T细胞活性、CAR表达的外源性控制以及CAR-T细胞的局部给药。
4. CAR-T细胞治疗脑干肿瘤：人体首次生物活性和安全性
弥漫性内源性脑桥胶质瘤（DIPG）是一种致命的脑干肿瘤，亟需创新疗法。B7-H3（CD276）是B7蛋白家族的免疫调节成员，几乎普遍在中枢神经系统（central nervous system，CNS）肿瘤上表达。基于使用靶向HER2或EGFR的局部区域CAR-T细胞治疗患有非脑桥DMG和其他中枢神经系统（CNS）肿瘤的儿科患者的I期临床试验经验（NCT03500991和NCT03638167），研究人员寻求开发B7-H3特异性CAR-T细胞，并开发局部区域B7-H3 CARs的I期临床试验，用于患有复发性/难治性CNS肿瘤（包括DIPG）的儿童。
近期《Cancer Discovery》首次报道了关于DIPG患者反复给药颅内B7-H3 CAR-T细胞的报告，包括初步耐受性、脑脊液中CAR-T细胞的检测、支持局部区域免疫激活的脑脊液细胞因子升高以及血清和脑脊液连续质谱的可行性。研究人员设计了B7-H3特异性CAR-T细胞，确认了它们的临床前疗效。数据表明重复颅内B7-H3 CAR T细胞给药的可行性，并且颅内给药可能诱导局部免疫激活。
5. 阻断IL-10增强人结直肠癌肝转移的抗肿瘤免疫功能
结直肠癌（CRC）是美国癌症相关死亡的第三大常见原因，结直肠癌肝转移瘤（CRLM）患者的生存率极低。程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1，PD-1）检查点抑制和过继细胞治疗在CRLM患者中的成功有限。
《Gut》最新的一项研究，评估了白细胞介素10（IL-10）阻断对CRLM切片培养物中内源性T细胞和CAR-T细胞抗肿瘤功能的影响。研究人员从人CRLM创建了器官型切片培养物，并测试了针对IL-10（αIL-10）的中和抗体的抗肿瘤作用，既可以单独治疗，也可以与外源性癌胚抗原（CEA）特异性CAR-T细胞联合使用。结果显示，αIL-10使人CRLM切片培养物中T细胞介导的癌细胞死亡增加了1.8倍。αIL-10显著增加CD8+ T细胞比例，无耗竭转录改变，人白细胞抗原-DR同种型（HLA-DR）巨噬细胞表达增加。αIL-10的抗肿瘤作用被主要的MHC-I或MHC-II阻断逆转，证实了抗原呈递细胞的重要作用。中断IL-10信号传导也从骨髓细胞介导的免疫抑制中拯救了小鼠CAR-T细胞增殖和细胞毒性。在人CRLM切片中，αIL-10增加了CEA特异性CAR-T细胞活化和CAR-T细胞介导的细胞毒性，在多种人类肿瘤中近70%的癌细胞凋亡。用IL-10受体阻断抗体进行预处理也增强了CAR-T功能。
因此，中和IL-10在人CRLM中的作用具有独立治疗和增强过继转移CAR-T细胞功能的治疗潜力。
6. 人T细胞的大规模敲入工程
细胞治疗应用中靶向敲入的效率通常较低，并且规模有限。《Nature Biotechnology》的一项研究开发了CLASH，这是一个能够实现高效、高通量敲入工程的系统。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与汇集的腺相关病毒相结合，使用大规模平行同源定向修复介导同步基因编辑和精确的转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体库，每个变体都具有靶向基因编辑。研究人员将这项技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了实时CLASH实验，从而实现了合并生成和无偏选择有利的CAR-T变体。研究人员从CLASH实验中发现了一种独特的CRISPR RNA（crRNA），能在CAR-T中产生PRDM1 的外显子3跳跃突变体，这导致这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命增加，从而在多种癌症模型中提高体内功效，包括实体瘤模型。CLASH的多功能性使其广泛适用于各种细胞和治疗工程应用。
7. 进化的AAV变体能对鼠T细胞有效基因编辑
使用同源定向修复将大型转基因精确靶向T细胞对于过继细胞疗法和T细胞生物学具有变革性。通过腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）递送DNA模板大大提高了敲入效率，但当前AAV血清型的嗜性限制了其在免疫缺陷小鼠模型中使用人T细胞。
为了在小鼠T细胞中实现靶向敲入，《Cell》上的一项研究进化了Ark313，这是一种合成AAV，在小鼠T细胞中表现出高转导效率。研究人员进行了全基因组敲除筛选，并确定QA2是Ark313感染的重要因素。他们证明了Ark313可用于无核转染DNA递送、CRISPR-Cas9介导的敲除以及大型转基因的靶向整合。Ark313能够在免疫功能模型中对Trac靶向的CAR-T和转基因TCR-T细胞进行临床前建模。鼠T细胞中的高效基因靶向具有改善细胞疗法的巨大潜力，并为实验性T细胞免疫学开辟了途径。
8. 优化hiPSCs源CAR-T细胞的增殖和持久性
CAR T细胞免疫疗法对实体瘤的有效性取决于肿瘤部位T细胞的积累、增殖和持久性。《Nature Biomedical Engineering》上的一项研究表明，可以通过从携带用于有效分化的CAR的单个人诱导多能干细胞克隆中提取和扩增CD8αβ细胞毒性CAR T细胞来增强实体肿瘤中CD8αβ细胞毒性CAR T细胞的增殖。
研究还表明，通过遗传敲除抑制抗原受体信号传导的二酰基甘油激酶，以及通过转导编码膜结合IL-15及其受体亚基IL-15Rα的基因的细胞，可以进一步增强肿瘤中效应细胞的增殖和持久性。在多种荷瘤动物模型中，工程化的hiPSC衍生的CAR-T细胞产生的治疗结果与携带相同CAR的原代CD8 T细胞相似。优化来源于多能干细胞的效应CAR-T细胞可能有助于开发用于治疗实体瘤的长效抗原特异性T细胞免疫疗法。
9. CD70：EGFR TKIs耐药性上调的治疗靶点
大约10%-15%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者携带表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）激活突变，初始标准治疗是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），但这些突变会对EGFR TKIs 产生耐药性，因此迫切需要新治疗方法。
近期《Cancer Cell》报道了一篇文章，研究了可能被基于抗体或过继细胞治疗方法靶向的细胞表面蛋白，并确定CD70在上皮间充质转换（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）相关耐药性中高度上调。此外，CD70上调是耐药性进化的早期事件，发生在耐药持久性细胞（drug-tolerant persister cells，DTPCs）中。CD70促进细胞存活和侵袭性，刺激CD70触发已知通过获得性TKI抗性重新激活的信号转导途径。抗CD70抗体药物偶联物 （antibody drug conjugates，ADCs）和CD70靶向CAR- T细胞、CAR-NK细胞，对EGFR TKI耐药细胞和DTPCs表现出有效活性。这些结果确定CD70是具有获得性EGFR TKI耐药性的EGFR突变肿瘤的治疗靶点，值得临床研究。
10. 可编程细胞纳米囊泡：增强针对实体瘤的CAR-T治疗
CAR-T细胞疗法在根除血液系统恶性肿瘤方面取得了显著成功。然而，由于存在免疫抑制性TME会导致CAR-T细胞的耗尽，并且免疫抑制细胞和免疫检查点可以显著减弱TME中CAR-T细胞的浸润和效应功能，其在治疗实体瘤方面的疗效一直受到限制。因此，通过改善肿瘤免疫代谢来重新编程抑制性TME，对于增强CAR-T细胞的浸润和效应功能，从而增强其对实体瘤的功效至关重要。
在《Advanced Materials》最新一篇研究中，开发了表达加载谷氨酰胺拮抗剂（D@aPD-L1 NVs）的高亲和力抗PD-L1 scFv的可编程细胞纳米囊泡，以代谢方式破坏免疫抑制肿瘤微环境并提高原位肺癌中抗间皮素CAR-T细胞的效率。由于抗PD-L1 scFv可以特异性结合肿瘤细胞上的PD-L1，D@aPD-L1 NVs能够将谷氨酰胺拮抗剂靶向递送到肿瘤部位，干扰PD-1/PD-L1抑制信号传导，解决谷氨酰胺拮抗剂和CAR-T细胞治疗引起的肿瘤细胞PD-L1上调，防止CAR-T细胞过早衰竭。
更重要的是，D@aPD-L1 NVs有效减少免疫抑制细胞的数量，促进炎症细胞的募集和肿瘤组织中炎性细胞因子的分泌。D@aPD-L1 NVs的这些独特功能改善了CAR-T细胞的浸润和效应功能，最终增强了CAR-T细胞的抗肿瘤能力和长期记忆免疫。D@aPD-L1 NVs的这些独特特性提高了CAR-T细胞治疗原位肺癌的疗效，显著降低了肿瘤复发，并为提高CAR-T细胞在实体瘤中的功效提供了新视角。
参考文献：
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