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这个GABA，一直穿着隐身衣
看不见，摸不着
GABA（γ-Aminobutyric acid，γ-氨基丁酸）广泛存在于动物的神经组织中，它一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，但如何实时准确监测其信号一直是个难题。
别怕，我有“显隐剂”
GABA无处遁形
开发GABA传感器的骨架有很多种选择，其中，GABAA和GABAB受体是不合适的，前者的GABA结合位点在蛋白质-蛋白质界面(而不是分子内)，而后者很难异源表达。此外，这些受体的过度表达可能会改变细胞生理。
Looger实验室经过筛选，以Pf622（一种来自于荧光假单胞菌中的GABA结合蛋白）为基础进行改造，插入了荧光报告基团cpSFGFP（它们在iGluSnFR中替代cpGFP提高了表达和光稳定性），N段加了出膜信号mito，C端加了膜锚定信号，在连接肽和GABA结合界面上做了优化，发明了iGABASnFR。
原始的iGABASnFR的最大∆F/F为2.5，与GABA的解离常数9µM，它对其他氨基酸亲和力很低或没有亲和力。它对类似的四碳代谢物没有亲和力。Looger实验室做了额外的努力，做出了：
iGABASnFR.F102G （∆F/F提高到4.5但Kd降低到50μM）
iGABASnFR.F102Y.Y137L （∆F/F提高到3.5，Kd降低到70μM）
以及其他几个突变版本。
你看这膜，它又亮又圆
精准膜定位，接收GABA
左：iGABASnFR.F102G
右：iGABASnFR.F102Y.Y137L
同样，在AAV2/1-hSyn-iGABASnFR感染P0新生大鼠海马神经元的原代培养中，iGABASnFR在体外14d显示出良好的膜定位和亮度，但F102G和F102Y.Y137L突变体变暗，并在细胞内有积累。
左：iGABASnFR.F102G
右：iGABASnFR.F102Y.Y137L
你看这线，它们又亲又密
实时响应，几乎零延迟
在体小鼠癫痫模型中，将AAV2/1-hSyn-iGABASnFR(或变体)注射到小鼠V1的2/3层。皮下注射毛果芸香碱诱导癫痫样活动，持续时间长达60分36秒。发作间歇期与多棘波和ECoG发作交替出现，持续1-2分钟。iGABASnFR荧光信号显示了与发作间期尖峰时间相符的瞬变。
在定型多峰期间，荧光峰间隔<1s可以用iGABASnFR.F102G(图b)分辨。在持续1分钟的癫痫发作期间，可以看到与低频ECoG成分一致的离散峰值(图c)。在癫痫发作期间荧光逐渐减弱，在癫痫发作之间的心电图静默期间缓慢恢复(图d)。由于这种缓慢的下降在发作间歇期和高峰期未见(图a，b)，所以并不能归因于光漂白，是因为iGABASnFR对pH的变化比较敏感。癫痫发作过程中的细胞外酸化已有大量文献记载，并被认为有助于终止癫痫。虽然这种对荧光变化的描述与GABA的激增和细胞外pH的变化是一致的，但使用GABA不敏感的pH指示器(如pHluorin)或改进的pH不敏感的GABA传感器的进一步实验将有助于区分这两种现象。
iGABASnFR黑色,F102G深灰色
F102Y.Y137L浅灰色
R205A黑白色圆圈,cpSFGFP绿色
斑马鱼小脑中的GABA。作为iGABASnFR在体内正常工作的最后一个证明，作者在一个虚构的游泳模型中使用光片成像观察斑马鱼小脑中的GABA瞬变。在斑马鱼中，虚构的游泳触发GABA能小脑浦肯野细胞的强烈激活。在游泳比赛中，可以观察到含有GABA能浦肯野细胞轴突的小脑神经纤维区发生了明显的荧光变化。这一结果表明，iGABASnFR可以检测到在运动中的GABA传递。
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