今天给大家解读一篇2月发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的题目为“Early hypoxia treatment and oxygen-concentration alteration promote the retinal progenitor proliferation and ganglion cell maturation in human retinal organoid development.”的文章。本研究旨在评估分阶段氧气调节（早期发育缺氧启动后转为常氧）能否改善视网膜类器官的生长、扩增祖细胞群并促进视网膜神经节细胞成熟，同时利用转录组分析明确其分子机制。研究使用H9人胚胎干细胞系，在四种氧气方案下分化为视网膜类器官，通过形态学、免疫荧光和转录组学进行分析。结果证实该策略能协同增强类器官发育，为疾病建模和再生应用提供了生理相关的方案。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！
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题目：《早期缺氧处理和氧气浓度变化促进人视网膜类器官发育中的视网膜前体细胞增殖和神经节细胞成熟》Early hypoxia treatment and oxygen-concentration alteration promote the retinal progenitor proliferation and ganglion cell maturation in human retinal organoid development
发表期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：7.3
研究背景：
视网膜类器官在研究人类视网膜发育、疾病机制和再生医学方面潜力巨大。然而，体外培养的类器官与正常胚胎发育形成的视网膜存在显著差异，限制了其临床应用。确保类器官的发育微环境尽可能模拟体内视网膜发育是关键策略。早期胚胎发育处于缺氧环境，视网膜发育与血供建立同步，氧气可用性直接影响发育。氧气水平与胚胎发生和干细胞命运决定密切相关，但关于低氧浓度在视网膜生成中的作用存在认知空白。大多数早期类器官分化方案在常氧下进行，不能反映早期视网膜生成的生理性低氧微环境。
研究思路：
- 细胞培养与分化：
使用H9人胚胎干细胞和hiPSCs，采用改良的SFEBq方案进行三维视网膜诱导。 - 氧气处理：
设立四组氧气方案：恒定常氧（20% O2）、持续缺氧（5% O2）、缺氧转常氧（5% → 20% O2，第6天转换）、常氧转缺氧（20% → 5% O2，第6天转换）。 - 评估指标：
在关键发育时间点（第6、12、18、45、60天）评估：①类器官形态与体积；②通过免疫荧光分析视网膜前体细胞和视网膜神经节细胞标志物（如CHX10， Ki67， PAX6， SOX2， TUJ1， NESTIN， ATOH7）的表达；③对第18天和第60天的样本进行RNA测序及转录组分析（差异表达基因、GO、KEGG富集分析等）。 - 统计分析：
使用单因素方差分析等进行统计比较。
研究亮点：
-
早期缺氧（5% O2，第0-6天）使类胚体体积增大约55%，并显著增加增殖性视网膜前体细胞（Ki67阳性）和视网膜神经节细胞前体细胞（ATOH7阳性）。 -
在发育第6天转换为常氧（20% O2）后，类器官能维持视网膜前体细胞的扩增，并诱导强健的视网膜神经节细胞分化，最终形成的类器官体积比持续缺氧组大38%。 -
转录组分析表明，缺氧转常氧处理的类器官在感觉和视觉系统发育通路上显著富集。 -
该方案不影响类器官顶-基底极性的建立和内在的发育轨迹。
研究结果：
- 生长动力学：
早期缺氧使第6天的类胚体体积比常氧组大55%。后续转为常氧的组别在第60天体积最大，比持续缺氧组大38%。而持续或延迟缺氧损害生长势头。 - 对早期祖细胞和分化的影响（第6天）：
早期缺氧显著增加了SOX2、PAX6、NESTIN等神经祖细胞标志物阳性细胞数，但几乎消除了CHX10阳性视网膜前体细胞，并使神经元标志物TUJ1阳性细胞减少63%。同时，缺氧使视网膜神经节细胞调节因子ATOH7阳性细胞增加2.46倍，低氧诱导因子HIF-1α表达显著上调。 - 祖细胞空间分布与增殖：
缺氧加速了SOX2从内层向外层的空间重分布，但延迟了内层PAX6的上调（提示延迟神经节细胞分化）。早期缺氧后转常氧的方案（5%→20% O2）最能减缓外层CHX10阳性细胞比例的下降，并在后期维持最高的外层CHX10/Ki67双阳性细胞比例，表明增强了视网膜前体细胞的增殖。 - 视网膜神经节细胞分化与成熟：
早期缺氧减少了早期TUJ1阳性细胞，但增加了ATOH7表达。当在第6天转换为常氧后，TUJ1阳性细胞比例增加，并在第18天内层达到峰值。到第60天，该组视网膜神经节细胞层中TUJ1阳性细胞的密度和轴突完整性更高，轴突投射更长更稳定。而持续缺氧则抑制了TUJ1表达和轴突形成。 - 转录组分析：
与恒定常氧或持续缺氧相比，缺氧转常氧组的差异表达基因在发育早期（第18天）显著富集于感觉系统发育、视觉系统发育、眼睛发育等GO条目；KEGG分析显示细胞外基质-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路等富集。到第60天，差异表达基因仍富集于视觉系统发育等相关通路。共同差异表达基因分析也支持分阶段氧气处理促进了视觉系统发育。
研究总结：
- 结论：
分阶段氧气调节（早期缺氧启动后转为常氧）能协同增强视网膜类器官发育。早期 hypoxia 扩增了祖细胞池并启动了视网膜神经节细胞谱系定向，而向常氧的过渡则支持了后续的视网膜神经节细胞分化和成熟。该策略为生成高保真视网膜类器官和富集成熟视网膜神经节细胞提供了有效途径。 - 讨论：
①早期生理性缺氧有利于神经祖细胞扩增，符合体内发育环境。②氧气梯度在神经组织命运决定中起关键作用，缺氧扩增祖细胞池，而较高氧气支持神经元分化。③早期 hypoxia 延迟了神经元标志物TUJ1的表达但增加了ATOH7，可能是在保持祖细胞特性的同时强化了向视网膜神经节细胞谱系分化的能力。④转录组提示PI3K-AKT信号通路可能是介导缺氧增强类器官发育的潜在机制。⑤局限性： 缺乏体内或电生理功能评估；主要使用H9 hESC系可能限制普适性；未来需在hiPSC平台上深入研究，并优化缺氧动态、评估光感受器发育等。
结果译文：
1.视网膜类器官的形成与缺氧处理
H9 hESC的核型分析鉴定出正常的二倍体女性染色体组成（46, XX），无非整倍体或结构畸变（补充图1）。使用改良的SFEBq培养方案将H9 hESC分化为ROs，显示了胚胎体从第6天的准圆形结构（附薄层神经上皮）（补充图2C）到第12-18天形成明显的神经视网膜层（补充图2D和E）的形态学进展。视泡样结构出现在第45-60天（补充图2F和G）。为了系统研究缺氧对视网膜发育的时间效应，建立了四个具有错时氧转换的实验组（补充图2B）：第1组（恒常20% O₂，常氧对照），第2组（恒常5% O₂，慢性缺氧），第3组（第6天20% → 5% O₂转换），第4组（第6天5% → 20% O₂转换）。在五个关键时间点（第6、12、18、45和60天）进行纵向取样，以捕捉动态发育变化。该设计能够精确解析缺氧在早期形态发生（第0-6天）与后期分化阶段（第6-60天）中的作用。
2.早期缺氧暴露影响视网膜类器官生长动态
定量分析显示，氧可用性强烈影响类器官的生长轨迹。在早期神经上皮阶段（第6天），缺氧导致胚胎体体积显著大于常氧对照（0.34 ± 0.007 mm³ vs. 0.22 ± 0.02 mm³，约增加55%，P < 0.001；图1A、B和S），表明在低氧条件下初始细胞聚集和组织扩增增强。然而，到第12天，第2组的胚胎体体积比第1组小14%（图1C和D）。此外，氧转换产生了相反的效果。例如，与第1组相比，第3组（常氧→缺氧）在第45天表现出进行性生长抑制（5.29 ± 0.62 mm³ vs. 6.88 ± 0.69 mm³），而第4组（缺氧→常氧）则表现出加速的生长轨迹，与其他三组相比，胚胎体体积增加。在第60天，第4组的视网膜类器官体积最高（103.46 ± 11.07 mm³），与第1组（91.67 ± 7.38 mm³）相当，但比第2组大38%（64.83 ± 6.51 mm³，P < 0.001；图1O-S）。这些发现表明，早期缺氧增强了发育能力，而持续或延迟的缺氧则损害了视网膜类器官成熟过程中的生长势头。
3.缺氧增强祖细胞扩增但延迟视网膜神经元分化
第6天的高分辨率免疫荧光分析揭示了缺氧对早期类器官发育的双重影响（图2A-L）。然而，顶端-基底极性保持不变（图2G和H）。缺氧还增加了神经祖细胞群。例如，SOX2阳性细胞数量增加了2.15倍（P < 0.001），PAX6阳性细胞增加了2.33倍（P < 0.001），NESTIN阳性细胞增加了1.74倍（P < 0.001；图2C-F和M）。相比之下，视网膜谱系标记物在缺氧条件下显著减少。CHX10阳性视网膜祖细胞几乎缺失（P < 0.001；图2A、B和M）。此外，神经元谱系定型标志物TUJ1的丰度下降了63%（P < 0.001；图2E、F和M）。此外，RGC分化调节因子ATOH7的丰度在缺氧条件下增加了2.46倍（P < 0.001；图2I和J），表明向延迟分化的转变，而非谱系阻断。缺氧条件下HIF-1α的强烈诱导（与常氧相比增加3.78倍，P < 0.001；图2K-M）验证了缺氧反应通路的激活。这些效应在hiPSC来源的ROs中得到了重现（补充图3A-N），证实了这种发育反应在PSC来源之间的一致性。
4.缺氧加速SOX2的空间重分布但延迟PAX6上调
5.早期缺氧保留视网膜祖细胞并在氧恢复后增强其增殖
6.早期缺氧后接常氧促进RGC分化和轴突成熟
7.转录组分析揭示氧依赖性视网膜发育程序的差异
进行转录组分析以研究氧条件如何影响视网膜类器官发育的分子通路。由于20% O₂ + 5% O₂转换（第3组）在我们之前的分析中没有显示出有意义的结果，且不反映实际的生理情况，我们主要关注其余三组（第1、2和4组）。主成分分析显示样本按实验分组聚类，并表明发育阶段（PC1）贡献了最大的方差（补充图6A）。相关性分析也表明同组样本之间存在高相关性（补充图6A和B）。在第18天，与第1组相比，第4组分别有776和424个DEGs显著上调和下调（|log2FoldChange| > 0.58；P < 0.05）（补充图6A和C）。此外，与第2组相比，第4组分别有558和654个基因显著上调和下调（补充图6A和D）。在第60天，与第1组相比，第4组分别有312和293个DEGs显著上调和下调（补充图6A和E），而与第2组相比，分别有183和211个基因显著上调和下调（补充图6A和F）。
对第18天前50个DEGs的层次聚类突显了缺氧-常氧转换驱动的强大转录差异（图6A和D）。第4组与第1组之间的DEGs主要富集在胚胎器官发育、前脑发育和感觉系统发育等GO术语中（图6B），而第4组与第2组之间的DEGs主要富集在视觉系统、感觉系统和眼睛发育中（图6E）。第4组与第2组之间DEGs的KEGG分析鉴定出细胞外基质-受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用和PI3K-AKT信号通路的富集（图6C和F）。DEGs富集最显著的前10条KEGG信号通路，包括神经活性配体受体相互作用、蛋白质消化吸收通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，如图6F所示。使用维恩图的交集分析鉴定出第4、1和2组之间共有的320个DEGs（图6G）。这些DEGs在GO术语中主要富集于相机型眼睛发育、眼睛发育、视觉系统发育和感觉系统发育（图6H）。KEGG分析显示这些基因主要富集在ECM受体相互作用、PI3K-AKT信号通路和神经活性配体受体相互作用通路中（图6I）。
第60天第4组的前50个DEGs如图7A和D所示。第4组与第1组之间DEGs的GO分析鉴定出其富集于感觉系统发育、视觉系统发育和眼睛发育（图7B）。图7C显示了DEGs富集最显著的前10条KEGG信号通路，包括神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路和调控干细胞多能性的信号通路。第4组与第2组之间的DEGs在GO术语中主要富集于视觉系统发育、感觉系统发育和相机型眼睛发育（图7E）。图7F显示了DEGs富集最显著的前10条KEGG信号通路，包括神经活性配体受体相互作用和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。使用维恩图的交集分析鉴定出第4、1和2组之间共有的108个DEGs（图7G）。这些DEGs主要富集于视觉感知、光刺激的感觉感知、相机型眼睛发育、眼睛发育、视觉系统发育和感觉系统发育等GO术语中（图7H）。然而，对这些DEGs的KEGG分析未鉴定出任何显著通路（图7I）。
更多结果和补充图表：doi：10.1186/s13287-026-04924-7
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