1区7.7分！代谢组学+脂质组学双管齐下：15分钟快速检测揭示恒河猴衰老中鞘磷脂下降、甘油三酯升高，热量限制重编程衰老相关脂质谱

今天给大家解读一篇2月发表在《Molecular Systems Biology》上的题目为“Aging-linked systemic lipid signature is reprogrammed by caloric restriction in rhesus monkeys.”的文章。本研究首先致力于解决代谢组学/脂质组学分析通量低的技术瓶颈，开发了一种快速、整合的分析方法。随后，利用此方法，研究人员对一个持续约30年的恒河猴热量限制研究队列的血浆样本进行了纵向分析。通过对359种生物分子的定量，系统评估了年龄、饮食（CR）和性别对血浆代谢物和脂质谱的影响。主要发现包括：年龄是引起变化的最主要因素；CR能特异性逆转衰老相关的SMs下降和DGs、TGs上升；雌性个体具有更高的含PC脂质水平。这些发现揭示了CR延缓衰老过程中系统脂质代谢的重编程，并强调了性别差异的重要性。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！

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团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
           
           
           

            
           
           
           

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CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

研究亮点：

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1. 长期纵向数据集
   首次对恒河猴进行了长达数十年的血浆代谢组与脂质组纵向分析，揭示了随时间动态变化的生物学过程。
2. 创新分析方法
   建立了一种高通量、快速的整合分析方法，可在单次15分钟分析内同时检测代谢物和脂质，适用于大规模研究。
3. 系统性发现
   系统性地解析了年龄、饮食（CR）和性别三大因素对全身脂质特征的独立及交互影响。
4. 与疾病风险关联
   发现的脂质变化（如DGs、TGs升高，SMs降低）与人类衰老相关疾病（如胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病）的风险标志物一致，增强了发现的临床相关性。

研究结果：

1. 方法学性能
   所开发的15分钟方法在人和猴血清中均表现出良好的重现性（中位RSD分别为10.68%和8.75%），成功鉴定出包括小分子和脂质在内的多种化合物类别。
2. 年龄是主要驱动因素
   PCA显示，年龄解释了数据中近30%的变异，是导致代谢和脂质组变化的最强因素。
3. 热量限制的调节作用
• CR使血浆中SMs的丰度显著升高，而使DGs和TGs的丰度显著降低。
• 这些变化逆转了衰老本身导致的趋势（衰老使SMs降低，DGs和TGs升高）。
• 例如，SM d36:1和亚油酸在CR猴子中更高，而PC 32:1和TG 50:3则更低。
• 相关性网络分析显示，CR改变了一些生物分子对之间的关联关系。
4. 性别二态性
• 雌性猴子体内含磷胆碱的脂质（如PCs和缩醛磷脂-PCs）丰度显著高于雄性。
• 睾酮在雄性中更高，并随年龄下降。
• 一些脂质（如lysoPC 16:1， PC 38:6）的丰度仅在雄性中表现出成年早期的下降。
5. 年龄相关变化及其与饮食、性别的交互
• 312种生物分子与年龄显著相关。随年龄增加的主要是PCs和高不饱和脂质；随年龄减少的主要是SMs、lysoPCs和低不饱和脂质。
• 年龄与饮食存在交互作用：CR减缓了DGs和烷基-TGs随年龄上升的速度，但增加了lysoPCs随年龄上升的速度。
• 年龄与性别存在交互作用：例如，缩醛磷脂-PC P-40:7等脂质在雄性中随年龄变化率更高，而亚油酸、酰基肉碱等在雌性中变化率更高。

研究总结：

结果译文：

我们首先选择了一种在分子极性之间平衡保留、确保广泛生物分子有效分离的流动相组成，并且能够在单根色谱柱上成功分离肽和脂质（Kraus et al, 2025; He et al, 2021）。这种MOST（多组学单次分析）流动相系统由100%水相作为流动相A和90%异丙醇/10%乙腈作为流动相B组成。与代谢组学领域常用的流动相（即100%甲醇作为流动相B）（Man et al, 2021; Windarsih et al, 2022）相比，含有90%异丙醇的MOST梯度对洗脱极非极性代谢物（脂质）具有更强的洗脱能力。我们评估了在流动相B中添加和不添加甲酸铵的情况，发现甲酸铵对于中性脂质（如甘油二酯和甘油三酯）的检测至关重要，且对极性代谢物的影响最小。此外，我们测试了多种梯度曲线（线性和阶梯式），以确定最佳的峰形和分辨率，从而提高分析物覆盖率。我们还考虑了整体分析时间，目标是实现快速的15分钟方法。我们发现从0到100% B的6分钟线性梯度提供了良好的代谢物覆盖率，并使我们能够实现目标（图1A,B和附录表S1）。

接下来，为找到在整个梯度中维持峰形的最佳复溶溶剂，我们测试了四种不同的复溶溶剂：（a）9:1甲醇:甲苯，（b）30%甲醇，（c）50%甲醇，和（d）8:23:69 正丁醇:乙腈:水。这些溶剂因其在平衡不同疏水性分子的溶解性方面的能力，已在先前的代谢组学和脂质组学应用中使用过（Danne-Rasche et al, 2018; Overmyer et al, 2021）。通过评估掺入不同溶剂复溶的NIST1950提取物中的同位素标记内标（氨基酸和Avanti SPLASH脂质）的峰形来评估其性能。单个标准品的代表性离子色谱图如图1C所示。在测试的溶剂中，甲醇:甲苯（90:10，v/v）对于脂质回收最佳，为脂质提供了最高的信号强度。然而，它导致小极性代谢物的丰度降低和峰形质量差。相比之下，正丁醇:乙腈:水（8:23:69，v/v/v）对小极性代谢物提供了更好的性能，保持了良好的峰形和合理的强度。然而，它对脂质的效果最差，导致所有脂质标准品的信号最弱，这很可能是由于该复溶溶剂的高含水量。总体而言，我们发现30%甲醇和50%甲醇作为平衡溶剂，对代谢物和脂质标准品均提供了中等性能。然而，50%甲醇在所有代谢物和脂质标准品中提供了最高的整体强度，使其成为在同时进行代谢物和脂质分析时实现稳健且平衡回收的最合适选择。

最后，为评估灵敏度和检测限，我们检查了内标（C¹³N¹⁵氨基酸和Avanti SPLASH混合物）在NIST1950提取物背景中的稀释系列；每个内标在其混合物中的浓度各不相同（见方法和附录表S2）。我们发现大多数氨基酸在从50 mM到45 mM的范围内均能检测到线性响应，代表性氨基酸绘制在附录图S1A中。对于脂质，我们在测试的最高浓度下检测到12种脂质中的8种。在这些检测到的脂质中，磷脂酰胆碱15:0/18:1(d7)、鞘磷脂18:1/18:1(d9)和甘油三酯15:0/15:0/18:1(d7)在0.4至200 μM范围内保持线性响应（附录图S1B）。在NIST1950提取物中，我们发现平均而言，氨基酸和脂质都在内标的线性响应范围内。

为评估我们15分钟LC-MS/MS方法的稳健性和可重复性，我们使用NIST1950人血浆（一种经过充分研究的、合格的代谢组学和脂质组学研究参考标准品）的提取物评估了定量性能。此外，鉴于我们最终目标是分析大型猴（恒河猴）血浆样本队列，我们比较了该方法在NIST1950和购买的BioIVT猴血清池的技术重复中的分析物覆盖率（图2A）。

我们首先评估了使用Compound Discoverer和LipiDex处理软件在NIST1950和猴血清池样本的三次技术重复中鉴定的特征数量（图2B）。在NIST1950中，我们平均鉴定出178个特征（代谢物和脂质），在猴血清中平均鉴定出167个特征（图2A）。在三次技术重复中，大多数特征在全部三次重复中被一致检测到（图2B）。在NIST1950和猴血清中，定量特征的相对标准偏差中位数分别为10.68%和8.75%（图2C）。我们将所有鉴定出的特征按类别分类，发现NIST1950和猴血清中的特征分布相似（图2D）。在NIST1950中，我们检测到16种不同的脂质类别，而在猴血清中检测到14种。然而，在两个样本中，甘油三酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂都是最丰富的脂质类别。为评估我们方法对特定脂质类的分离能力，我们检查了甘油三酯的有效碳数与保留时间之间的关联（图2E）。正如预期，在NIST1950中，我们观察到保留时间与甘油三酯有效碳数之间存在强烈的正相关关系（R²=0.97）。该线性关系验证了我们方法基于疏水性分离脂质的能力。

我们在大型纵向恒河猴队列中应用了开发的方法。该队列始于1989年，初始纳入30只雄性猴，随后在1994年增加了30只雌性和16只雄性（图3A）。猴子被随机分配至对照组或热量限制组，其中CR组在3个月内逐步将食物摄入量减少30%（Colman et al, 2009）。所有猴子均喂养半纯化、营养均衡的饮食，蛋白质和脂肪含量相似。采集的血浆样本中位数为每只猴子7个（共494个样本），覆盖成年猴直至生命晚期的年龄范围（图3A）。分析这些样本时，我们在10天内连续运行了所有样本，同时监测质量控制样本以评估仪器性能。定量特征（n=359）显示，质量控制在10天内保持稳定（图3B）。此外，在每个样本的每个批次中，质量控制样本的重复运行在批次内保持一致（图3B）。鉴定出的特征，无论是已识别的（n=359）还是未识别的（n=3519），在整体研究中，都在亲水性和疏水性之间实现了良好的覆盖（图3C）。

为探索代谢物和脂质谱的总体模式，我们对所有定量特征（n=359）进行了主成分分析（图3D）。PC1主要与年龄相关，PC2与性别相关（图3D；图EV1A,B）。尽管饮食（对照与热量限制）对整体代谢组有较小的影响，但PC1与年龄的关系在CR动物中略强（R²=0.73 vs. 0.69）（图EV1C）。PC2与性别相关的特征在年龄上相对稳定（图EV1D）。

为解析饮食、性别和年龄对血浆代谢物和脂质谱的影响，我们使用了线性回归模型，将猴ID作为随机截距。在控制年龄和性别后，我们评估了饮食对生物分子丰度的贡献（图4A）。我们鉴定出58种与饮食显著相关的生物分子（调整后p<0.05）。这些显著的生物分子中，57种是脂质（图4A）。我们的分析显示，CR猴和对照猴之间的脂质存在显著差异，特别是鞘磷脂、甘油二酯和甘油三酯（图4A）。CR猴循环中SM丰度显著更高，而DG和TG丰度显著更低，表明脂质代谢的特定方面对CR饮食有反应。接下来，我们使用基于排名的富集分析，使用诸如化合物类别、脂肪酸酰基不饱和度水平和奇/偶数链脂肪酸酰基组成等类别（图4B；附录图S3）。正如火山图可能预期的那样，SM是CR中最显著富集的脂质类（图4B），而TG、DG和神经酰胺（Cer[NS]）在CR中相对于对照组呈负富集。饮食对特定类别的影响在图EV2A中进一步可视化。有趣的是，先前研究循环因子与胰岛素抵抗关联的文献报告了基于DG组成的胰岛素敏感性丧失预测模型，该模型独立于肥胖，且在高血糖之前有效（Polewski et al, 2015）。此外，在本研究呈现的猴队列先前发表的数据中，对照猴的空腹血糖水平在23岁左右开始升高，表明向胰岛素抵抗转变（Mattison et al, 2017）。通过定期葡萄糖耐量试验也监测了这些猴的血糖调节损伤，对照猴（而非CR猴）早在7岁就显示出血糖调节损伤。值得注意的是，DG和TG的升高出现在空腹血糖升高（~20岁）之前，并且与对照猴相比CR猴的肥胖症升高密切相关。DG和TG的升高常与胰岛素抵抗同时发生（Ormazabal et al, 2018），我们的数据显示对照猴中DG和TG升高与此观察一致。除TG和DG外，Smith等人（2022）还确定了SM在猴从健康向代谢综合征转变中的作用，表明脂质特征在索引代谢健康状态方面可能具有实用性。

为研究雄性和雌性猴的脂质和代谢物谱的性别差异，我们使用了线性回归方法。在评估性别效应时，同时考虑饮食效应和年龄，使用混合效应多元线性回归分析。在此，我们发现有50种注释生物分子在雌性中的丰度显著高于雄性，有6种注释生物分子在雄性中的丰度显著高于雌性（图5A）。基于排名的富集分析显示，在雌性中显著富集的类别包括非常高不饱和（>3）和高不饱和（2-3）脂质（图5B）。在性别相关的显著生物分子中，含胆碱的磷脂（如PC和缩醛磷脂酰PC）在雌性中显著更高，而睾酮、DL-色氨酸和几种溶血磷脂酰胆碱在雄性中更高（图5C；图EV3A）。在这些性别特异性生物分子中，雌性中最高的倍数变化是缩醛磷脂酰PC P-40:7和PC 40:7，而雄性中最高的倍数变化是DL-色氨酸和睾酮（图5C）。在绘制随时间变化的丰度图时，我们观察到几个物种的性别差异一直持续到晚年（图5D；图EV3B；附录图S5）。具体来说，PC 40:7和缩醛磷脂酰PC P-40:7在雌性中持续升高，而睾酮和DL-色氨酸在雄性中持续升高（图5C,D）。我们还观察到一些溶血磷脂酰胆碱，如溶血磷脂酰胆碱16:0、溶血磷脂酰胆碱16:1和溶血磷脂酰胆碱18:0，在雄性中的丰度高于雌性。对于溶血磷脂酰胆碱16:0和溶血磷脂酰胆碱18:0，差异在大多数生命阶段保持一致；对于溶血磷脂酰胆碱16:1，仅在早期生命阶段观察到差异（图EV3B）。总的来说，观察到的脂质和代谢物谱的性别二态性，包括雄性中睾酮丰度更高和雌性中含胆碱磷脂（如PC和缩醛磷脂酰PC）丰度更高，强烈表明生物学性别在驱动这些循环代谢特征中发挥作用。

由于年龄对生物分子丰度的强烈影响，我们使用线性回归方法评估了年龄的影响以及年龄与饮食、性别之间的相互作用。我们发现312种生物分子与年龄显著相关（图6A）。随年龄增长而增加最多的生物分子包括溶血磷脂酰胆碱20:5、壬二酸和PI 18:0-20:4。这些随年龄升高的生物分子在磷脂酰胆碱和高不饱和脂质中富集（图6B；附录图S6A）。随年龄增长而减少的生物分子包括溶血磷脂酰肌醇18:0、天冬氨酸和辛二酸。总体而言，这些随年龄减少的生物分子在鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和极低不饱和脂质中富集。值得注意的是，溶血磷脂酰胆碱随年龄下降已在先前的人类研究中报道。Pan等人（2023）报道了中国老年人血浆中溶血磷脂酰胆碱下降，表明其作为衰老生物标志物的潜力。同样，在巴尔的摩纵向衰老研究中，较低的血浆溶血磷脂酰胆碱水平与骨骼肌线粒体氧化能力受损相关（Semba et al, 2019）。

为探索作为饮食函数的生物分子之间的关联，我们对对照喂养猴（n=236个样本）和CR猴（n=258个样本）中的生物分子进行了Kendall's Tau（τ）相关性分析。相关性矩阵分别可视化为对照猴和CR猴的热图，将对照矩阵的层次聚类强加于CR矩阵，以便比较不同饮食条件下的相关性（图7A）。对照和CR样本之间的相关模式总体相似，并且像SM（聚类12）、溶血磷脂（聚类3和11）以及TG和DG（聚类6）这样的生物分子表现出高度的类内正相关。值得注意的是，溶血磷脂聚类（富集溶血磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰胆碱）与包含缩醛磷脂酰PC、磷脂酰肌醇、DG和PC的聚类（聚类7和10）呈强负相关。这种负相关可能由年龄诱导的变化驱动。PC是随年龄增长最显著的生物分子之一，而溶血磷脂酰胆碱则随年龄下降（图6A,B）。在对照喂养样本中，这种负相关比在CR样本中更强，这提示CR可能改变了这些与年龄相关的变化。这进一步得到以下证据的支持：CR导致DG随年龄的变化率降低，而溶血磷脂酰胆碱和缩醛磷脂酰PC随年龄的变化率增加（图6C,D）。溶血磷脂酰胆碱和缩醛磷脂酰PC之间的这种负相关可能与缩醛磷脂酰PC的回收机制有关，后者在其乙烯基醚键处螯合活性氧，随后再循环为溶血磷脂酰胆碱（Faria et al, 2024）。

为进一步探索CR猴和对照喂养猴之间的差异，我们计算了每对生物分子的相关性值之差，即Δτ = τ(CR) - τ(对照)，其中τ是两种生物分子之间的相关性（图7B）。在此，我们发现相关性值的差值遵循以0为中心的高斯分布，仅少数生物分子对在CR猴与对照猴中的相关性不同。为探索CR猴与对照喂养猴之间差异最大的生物分子对，我们基于其Δτ绘制了前50个差异对的弦图（图7C）。一个显示正Δτ值的生物分子对的例子是SM d36:1和溶血磷脂酰乙醇胺20:4；这些分子在对照猴中呈负相关（τ=-0.35），但在CR猴中没有强相关性（图7D）。相比之下，一个显示负Δτ值的生物分子对的例子是单油酸甘油酯和Cer[NS] d18:1_24:0（图7E）。在这一对中，我们在对照猴中看到正相关（τ=0.38），而在CR猴中没有相关性。对于这两个例子，这四个生物分子与饮食（图4源数据）和年龄（图6A）均显著相关，但令人惊讶的是，它们与饮食×年龄的交互作用并不显著。然而，这可能表明这些分子在CR下经历了更细微的变化，例如在最近的人类研究中观察到的随年龄变化的拐点差异（Shen et al, 2024）。

更多结果和补充图表：doi：10.1038/s44320-025-00177-3

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