三阴性乳腺癌转移基因组图谱重磅发布！PKD1突变驱动免疫治疗耐药。三阴性乳腺癌（TNBC）转移后治疗困难，基因组特征尚不明确。本研究对296例TNBC转移灶进行484基因靶向测序，绘制了最大规模的转移基因组图谱。发现PKD1突变在转移灶中富集（8%），且与抗PD-1免疫治疗耐药显著相关（3个独立临床试验验证）。多组学分析（TCGA/METABRIC/FUSCC）显示：PKD1高表达与CD8A、PD-L1负相关，且在免疫调节亚型中最低，提示其塑造“沙漠型”肿瘤免疫微环境。机制上，PKD1通过上调CCL2抑制M1型肿瘤相关巨噬细胞浸润及CD8+ T细胞活化。动物模型中，抗CCL2联合抗PD-1可逆转PKD1介导的免疫耐药。该研究为吞噬调节因子-巨噬细胞相关热点提供了TNBC免疫治疗新靶点（PKD1/CCL2轴），并提示PKD1可作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物！
今天给大家解读一篇3月发表在《The Journal of Clinical Investigation》上的题目为“Comprehensive genomic profiling of triple-negative breast cancer metastases identifies role of PKD1 in immunotherapy resistance.”的文章。本研究旨在深入探索mTNBC的基因组特征。研究团队对复旦大学附属肿瘤医院收治的296例mTNBC患者的转移灶样本进行了靶向测序（484基因 panel），系统描绘了其基因组图谱。通过多维比较分析（不同转移器官、中西人群、原发与转移灶），发现PKD1突变在转移灶中显著富集。临床疗效分析显示，PKD1突变/高表达与抗PD-1治疗耐药相关。进一步的机制研究揭示，PKD1通过上调CCL2，抑制具有抗肿瘤活性的M1型巨噬细胞浸润，从而形成免疫“荒漠”微环境。最终，在动物模型中验证靶向CCL2可逆转PKD1介导的免疫治疗耐药。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《三阴性乳腺癌转移灶的综合基因组分析确定了PKD1在免疫治疗耐药性中的作用》Comprehensive genomic profiling of triple-negative breast cancer metastases identifies role of PKD1 in immunotherapy resistance
发表期刊：The Journal of Clinical Investigation
影响因子：13.6
研究背景：
三阴性乳腺癌（TNBC）预后差，易早期复发和远处转移。尽管免疫检查点抑制剂等新疗法出现，但多数mTNBC患者仍因缺乏有效靶点或产生耐药而治疗选择有限。基因组研究对TNBC精准治疗至关重要。然而，既往研究多关注原发性乳腺癌，对转移灶尤其是亚洲人群的基因组改变认知有限。原发灶与转移灶之间存在基因组差异，因此获取转移灶的基因组信息对指导晚期治疗尤为关键。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 队列建立与测序
前瞻性收集296例mTNBC转移灶及配对血样，使用484基因panel进行靶向测序，获取体细胞突变和拷贝数变异数据。
- 基因组图谱描绘与比较
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比较中国（FUSCC队列）与西方（MSKCC队列）mTNBC的基因组差异。
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比较原发灶（n=252）与转移灶（n=296）的基因组差异，并在独立配对队列（52例患者，105份样本）中验证关键发现。
- 疗效分析与生物标志物挖掘
在真实世界治疗和三项前瞻性临床试验（NCT03805399, NCT04129996, NCT04395989）中，分析基因组改变与免疫治疗疗效的关联。
- 机制探索
通过多组学数据分析、细胞系构建（敲低/过表达PKD1）、免疫健全/缺陷小鼠模型、流式细胞术、RNA测序、免疫组化等技术，阐明PKD1影响肿瘤免疫微环境及介导耐药的分子机制。
- 治疗策略验证
在过表达PKD1的免疫健全小鼠模型中，评估抗PD-1单药、抗CCL2单药及两者联合治疗的抗肿瘤效果及对肿瘤免疫微环境的改变。
研究亮点：
- 大规模中国人群数据
提供了迄今为止最大规模的中国mTNBC转移灶基因组图谱，弥补了该人群数据的空白。
- 临床转化导向明确
从基因组发现（PKD1富集）直接关联至临床疗效（免疫治疗耐药），并贯穿了机制探索（CCL2通路）和治疗策略（联合靶向CCL2）。
- 多层次验证
发现先后在独立配对队列（n=105）和三项独立的临床试验（FUTURE, FUTURE-C-PLUS, FUTURE-SUPER）中得到验证，增强了结论的可靠性。
研究结果：
- 基因组全景
中国mTNBC转移灶最常见的体细胞变异是TP53（76%），其次是PIK3CA（21%）、RYR2（10%）和PKD1（8%）。MYC是最常见的拷贝数扩增基因（54%）。
- 比较分析发现PKD1在转移灶富集
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与原发灶相比，PKD1、MTOR、NOTCH1、ERBB3等基因突变在转移灶中显著富集。
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在独立配对队列中再次验证PKD1突变在转移灶中富集。
- PKD1与免疫治疗耐药相关
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在FUSCC真实世界队列中，所有3名PKD1突变患者在接受抗PD-1治疗后均出现疾病进展，而野生型患者的客观缓解率为69.4%。
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在三项前瞻性临床试验中一致观察到，PKD1突变或高表达与更短的无进展生存期和更差的治疗反应相关。
- PKD1塑造“荒漠型”免疫微环境
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多组学数据显示，PKD1高表达与CD8A、CD274（PD-L1）表达呈负相关，且在免疫调节型（IM）亚型中表达最低。
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单样本GSEA提示PKD1高表达患者肿瘤免疫细胞浸润有限。
- 体内外机制验证
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在免疫缺陷小鼠中，改变PKD1表达不影响肿瘤生长；但在免疫健全小鼠中，PKD1敲低抑制肿瘤生长和肺转移，过表达则促进之。
- PKD1
敲低导致肿瘤微环境中GZMB+和穿孔素+ CD8+ T细胞以及M1型巨噬细胞浸润增加。
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RNA-seq和IHC显示PKD1敲低后CCL2表达下降。CCL2是抑制M1型巨噬细胞浸润的关键趋化因子。
- 靶向CCL2可逆转耐药
在过表达PKD1的免疫健全小鼠模型中，抗PD-1单药效果有限，而抗PD-1联合抗CCL2治疗能显著抑制肿瘤生长，并增加肿瘤内M1型巨噬细胞和CD8+ T细胞的浸润。
研究总结：
本研究通过对中国mTNBC转移灶的大规模基因组分析，全面描绘了其基因组特征，并首次将PKD1确立为一个关键的免疫治疗耐药调节因子。PKD1通过上调CCL2，抑制抗肿瘤免疫细胞（特别是M1型巨噬细胞）浸润，从而形成“荒漠型”肿瘤免疫微环境，导致免疫治疗耐药。靶向CCL2联合抗PD-1治疗在临床前模型中显示出克服此耐药的潜力，为未来针对PKD1高表达或突变mTNBC患者的精准免疫联合治疗提供了新策略。
讨论部分同时指出本研究的局限性：包括回顾性分析可能存在残留混杂因素、免疫治疗队列样本量相对较小、Panel测序范围有限、缺乏多区域测序以解析瘤内异质性等。未来需要在更大规模的前瞻性队列、结合多组学技术和多区域采样进行进一步验证和探索。
结果译文：
为了全面描述TNBC转移的基因组特征，我们前瞻性收集了2018年10月至2020年11月期间在复旦大学上海癌症中心（FUSCC）接受治疗的mTNBC患者的296份TNBC转移灶及配对外周血样本（补充图1、A和B）。我们使用FUSCC乳腺癌相关484基因panel对所有转移灶进行了靶向NGS测序，并收集了体细胞突变和拷贝数变异的数据。我们从3个主要方面描述了TNBC的基因组差异：（a）不同转移器官之间，（b）中国和西方人群之间，以及（c）FUSCC队列中配对与非配对的原发灶和转移灶之间。此外，我们分析了与免疫治疗疗效相关的基因组改变并探索了潜在机制，强调了转移灶基因组分析的转化相关性（图1A）。
共记录了来自296名mTNBC患者的796次转移事件，涉及18个器官部位。最常见的转移部位是淋巴结（n=213）、肺（n=142）、骨（n=129）、肝脏（n=99）和胸壁（n=93）（图1B和补充图1C）。mTNBC患者器官特异性转移的频率与先前研究报告的相当（29）。对于有多发转移事件的患者，我们为每位患者选择并测序了1个代表性转移灶。296个转移灶活检部位的分布和比例如图1C所示，主要活检部位为淋巴结、肝脏、肺和胸壁，分别占活检的28.72%、22.97%、15.20%和15.20%。与在纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC，n=143）研究的西方mTNBC临床队列相比，我们的队列包含了显著更高比例的经重度预治疗患者（定义为入组前已接受≥3线针对转移性疾病的全身治疗的患者）（27.8% vs. 13.2%；P<0.001，补充图1D）。注意，FUSCC队列和MSKCC队列中mTNBC患者的临床特征总结于补充图1D和补充表1。
我们描述了296例TNBC转移的基因组景观，包括突变基因、突变位点和CNV（图2）。我们队列中TNBC转移最常见的体细胞变异是TP53（76%），其次是PIK3CA（21%）、RYR2（10%）、USH2A（9%）、KMT2D（9%）和PKD1（8%）（图2A）。对主要突变基因的变异等位基因频率（VAF）比较显示，TP53、PIK3CA、PTEN和RB1是前4个VAF，其绝对高VAF大于30%（补充图2A）。频率最高的突变位点是PIK3CA p.H1047R，占观察到的突变的12%（图2B）。在我们的mTNBC队列中，MYC是最常见的拷贝数改变基因；它发生在54%的患者中。这些改变绝大多数是扩增（图2C）。
为了研究基因组改变之间的相互关系，我们分析了突变基因的共现性和互斥性。我们没有观察到任何显著的相互排斥性，但鉴定出这些突变基因之间的几种共现模式。其中，PKD1和KMT2B之间存在广泛的共现突变（补充图2B）。此外，染色质组蛋白修饰通路与其他通路共现突变的频率最高（补充图2C）。总体而言，我们的研究揭示了迄今为止最大的TNBC转移综合基因组景观，有助于更深入地了解TNBC转移。
为了研究特定基因组特征在TNBC转移中的器官趋向性，我们比较了不同转移器官之间的基因组改变。按转移部位分组的特定器官基因组特征癌谱图见补充图2D。我们观察到PIK3CA突变在不同器官之间的分布存在显著差异（补充图2E，P<0.05）。值得注意的是，转移至乳腺的病变相比其他器官的转移灶具有更高的PIK3CA突变患病率。这一现象背后的生物学机制值得进一步研究。
接下来，我们比较了中国和西方人群之间基因组突变的差异。MSKCC mTNBC队列（33）包含公开的TNBC转移基因组数据，被用作西方mTNBC队列的代表。MSKCC队列中TNBC转移最常见的体细胞突变是TP53（93%），其次是PIK3CA（13%）和NF1（11%）（补充图3A）。与中国FUSCC mTNBC队列相比，MSKCC队列在TP53（93% vs. 76%）、NF1（11% vs. 4%）、BRCA1（6% vs. 1%）和FGFR4（4% vs. 1%）中的突变率更高，但在PIK3CA（13% vs. 21%）、CREBBP（1% vs. 6%）和KMT2B（1% vs. 6%）中的突变率更低（补充图3B）。与西方患者相比，中国mTNBC患者在基因组完整性（82% vs. 94%）和细胞周期通路（8% vs. 16%）中的改变显著更少（补充图3C）。
我们将已建立的TNBC转移队列的基因组数据与我们中心的原发性TNBC数据（8,32）进行比较，以识别可能促进肿瘤进展的新基因组改变。与原发灶相比，许多基因突变如PKD1、MTOR、NOTCH1和ERBB3在转移灶中富集，而只有KMT2C在原发灶中富集程度更高（图3A）。我们进一步分析了一个新的队列，包含来自52名原发性与转移性TNBC配对的105个肿瘤样本（包括1例2个原发灶匹配1个转移灶）。绘制这些配对样本的突变图谱证实了上述非配对队列中的发现：与配对的原发灶相比，PKD1突变在转移灶中显著富集（图3B）。这些发现与MTOR、NOTCH1和ERBB3信号通路在肿瘤进展和治疗耐药中频繁被报道的作用一致（34-38），为我们的比较提供了可信度，并强调了进一步研究PKD1对恶性肿瘤行为潜在影响的必要性。
为了探讨导致转移灶与原发灶之间遗传突变谱差异的因素（18,39），我们特别研究了治疗压力和自然疾病进展的影响。首先，我们比较了未经治疗的TNBC转移灶与原发灶之间的突变频率，发现转移灶中富集了大量基因（如NOTCH1和ERBB3，补充图4A）。接下来，我们对不同治疗压力下的转移灶进行了内部比较。我们的结果显示，未经治疗和经预处理的转移灶仍然呈现出明显的基因组差异（补充图4B）。这些发现表明，原发性和mTNBC病变在基因组突变方面存在显著差异，这很可能受到治疗压力和疾病自然进展的影响。由于缺乏详细的新辅助和辅助治疗史，不能排除残留混杂因素。因此，有必要在前瞻性、注释良好的队列中进行进一步验证。
4.疗效分析揭示PKD1表达作为免疫治疗的潜在生物标志物
活检后，患者接受了真实世界的、指南指导的全身治疗（补充图5A）。鉴于免疫检查点抑制剂在mTNBC中的应用日益广泛，我们基于基因组学对免疫治疗疗效进行了分析。在我们的FUSCC mTNBC队列中，39名患者接受了抗PD-1免疫治疗并有完整的疗效评估。我们的基因组分析揭示了多囊蛋白-1（PKD1）与免疫治疗耐药之间的有趣关联。在3名携带PKD1突变的患者中，根据RECIST v1.1标准，所有患者在首次疗效评估时均出现疾病进展。相比之下，PKD1-WT组对免疫治疗的客观缓解率为69.4%（36例中的25例，P=0.039；图3C）。这3名患者在免疫治疗前后的疗效评估和详细临床结果如图3D所示。
基于上述发现，我们在本中心进行的3项晚期TNBC患者独立临床试验中研究了PKD1突变与免疫治疗疗效之间的关系：FUTURE试验（NCT03805399）、FUTURE-C-PLUS试验（NCT04129996）和FUTURE-SUPER试验（NCT04395989）。值得注意的是，我们的发现一致表明，PKD1突变可能与TNBC中免疫治疗反应减弱相关（图3E和补充图5、B和C）。然而，鉴于临床队列规模较小，这些结果应谨慎解读，并需要在更大规模的前瞻性队列中进行验证。总体而言，我们证明转移灶的基因组分析将PKD1确定为免疫治疗的潜在生物标志物。
5.多组学研究揭示PKD1与“沙漠型”肿瘤免疫微环境相关
在研究中，我们发现转移灶中PKD1的突变率高达8%（具体突变位点见补充图6），在TNBC转移灶所有突变基因中排名第六（图2A）。此外，PKD1突变在TNBC转移灶中比在原发灶中更常见（图3、A和B），表明PKD1可能在TNBC进展和免疫逃逸中发挥重要作用。更重要的是，携带PKD1突变的患者对免疫治疗耐药（图3E和补充图5、B和C）。基于上述发现，我们研究了PKD1表达对TNBC的影响，因为很少有研究探讨这种作用。
我们随后对TCGA数据库的多组学数据分析进一步证实了PKD1突变与mRNA表达增加之间的相关性（图4A）。此外，我们将研究扩展到我们多组学队列中TNBC患者（n=360）的生存数据（8），发现PKD1高表达与TNBC患者不良预后之间可能存在关联（补充图7），尽管这些观察结果需要在前瞻性队列中进行验证。
我们接下来评估了在FUTURE临床试验（NCT03805399）中接受抗PD-1免疫治疗的患者中PKD1的免疫组织化学染色（图4B）。进一步分析显示，PKD1高表达患者在免疫治疗下的无进展生存期更差（图4C）。具体而言，在该队列中，PKD1高表达患者呈现出肿瘤增殖增加、治疗持续时间更短以及免疫治疗后肿瘤退缩不明显等特征（图4、D-F），值得对其分子机制进行进一步研究。
考虑到先前揭示的PKD1表达对免疫治疗和疾病预后的影响，我们全面分析了PKD1表达对肿瘤免疫微环境的影响。最初，我们关注了两种常用的免疫治疗反应临床生物标志物：CD8（由CD8A基因编码）和PD-L1（由CD274基因编码）。我们观察到在我们多组学TNBC队列（FUSCC）和METABRIC队列中，PKD1表达与这两种生物标志物的表达均呈一致负相关（图4、G-J），表明PKD1可能潜在地作为免疫治疗的生物标志物，需要进一步探索和验证。此外，我们分析了PKD1在TNBC四种分子亚型中的表达，发现其在免疫调节亚型中的表达显著低于其他三种亚型（图4K）。随后的基因集富集分析（40）显示，携带PKD1突变的TNBC患者富集了许多免疫负向的Treg信号通路（补充图8）。此外，我们采用单样本GSEA（41），表明PKD1高表达的TNBC患者在TIME内表现出有限的免疫细胞浸润，提示“沙漠型”TIME（图4L）。
我们进行了基础转化研究，以探究PKD1表达影响TNBC结局和TIME的潜在机制。我们通过蛋白质印迹和RT-qPCR评估了小鼠TNBC细胞系中PKD1的表达水平，并生成了具有差异PKD1表达的TNBC细胞系：4T07和TS/A通过shRNA介导进行表达敲低（42），而67NR和168FARN通过dCas9-SAM系统进行过表达（43）（图5、A-J，以及补充图9、A-F）。我们在上述4种细胞系上进行了一系列体外实验，观察到调节PKD1表达在体外并未显著影响肿瘤增殖或迁移（图5、A-J，以及补充图9、G-L）。
为了评估PKD1表达对体内肿瘤生长的影响，我们利用差异表达PKD1的细胞系在BALB/c小鼠中建立了多种模型：肺转移模型、免疫缺陷小鼠模型和免疫活性小鼠模型（图5K）。有趣的是，在免疫缺陷小鼠模型中，差异PKD1表达不影响肿瘤生长（图5、L和M）。然而，在免疫活性小鼠中，PKD1表达显著影响肿瘤生长（图5、N-Q）。具体来说，在原位肿瘤模型中，与对照组相比，PKD1敲低组的肿瘤生长被显著抑制（图5N）。类似地，在肺转移模型中，与对照组相比，PKD1敲低组的肺转移结节数量显著减少（图5P）。在PKD1过表达模型中观察到了一致的结果，其中PKD1表达促进了肿瘤增殖和肺转移（图5、O和Q）。
基于体外和体内模型的实验结果，以及关于PKD1介导的免疫治疗耐药的临床队列结论，我们假设PKD1表达可能在免疫逃逸中发挥重要作用。
为了阐明PKD1表达对肿瘤免疫逃逸的确切影响，我们对与PKD1差异表达相关的TIME进行了一系列分析。原位TIME细胞的流式细胞术分析显示，各组之间浸润免疫细胞存在显著差异（图6、A-D）。在PKD1敲低组中，GZMB+和perforin+ CD8+ T细胞的比例显著增加（图6、B和C）。此外，敲低PKD1表达显著增加了原位M1型肿瘤相关巨噬细胞的浸润水平，这有助于抗肿瘤免疫激活（图6D）。RNA-seq分析显示，PKD1低表达组在多个巨噬细胞相关通路中显著富集，包括细胞因子活性、趋化因子活性和C-C基序趋化因子受体2信号通路（补充图10）。结合TAM重编程现象和RNA-seq分析显示的大量富集的趋化因子和细胞因子相关通路，我们分析了可能影响TAM浸润的趋化因子和细胞因子（44,45），发现C-C基序趋化因子配体2的表达在PKD1表达敲低后显著降低（图6E）。如肿瘤组织的免疫组织化学所示，PKD1表达敲低后CCL2的表达显著降低（P<0.05，图6F）。对转移灶中TIME的多重免疫组织化学分析进一步证明，PKD1表达抑制了M1型TAM的浸润（图6G）。
先前的研究报道，CCL2是一种重要的巨噬细胞趋化因子，可抑制M1型巨噬细胞的浸润（44,45）。综上所述，我们的发现表明，PKD1可能通过上调CCL2来抑制M1型TAM浸润，从而介导TNBC中的免疫逃逸，进而介导“沙漠型”TIME。
鉴于缺乏直接靶向PKD1的药物，我们探索了新的治疗策略来对抗PKD1介导的“沙漠型”TIME和免疫治疗耐药。在过表达PKD1的免疫活性原位肿瘤模型中（图7A），我们再次证实PKD1表达促进了肿瘤生长并介导了抗PD-1治疗的耐药。值得注意的是，抗PD-1和抗CCL2联合治疗显著抑制了过表达PKD1的肿瘤生长（图7B）。为了评估治疗后的TIME变化，我们在最后一次抗体给药后收集的肿瘤组织上进行了多重免疫荧光（图7、C和D）和bulk RNA-seq（图7E）。结果表明，与单药治疗组相比，联合治疗组总体上表现出更高的免疫细胞浸润和更具免疫活性的微环境，同时M1型TAM和CD8+ T细胞显著富集（图7、C-E）。这些发现表明，靶向CCL2可以克服PKD1介导的免疫治疗耐药，为解决TNBC患者免疫治疗耐药提供了一种潜在的治疗选择。
更多结果和补充图表：doi：10.1172/JCI188989
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