今天给大家解读一篇3月发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上的题目为“Phase 1 pilot study for hemophilia-A: AAV8 vector with prophylactic tacrolimus-glucocorticoid achieves therapeutic FVIII activity.”的文章。本研究旨在评估基因疗法GS001在重度血友病A成人患者中的安全性和有效性。12名参与者被分为低剂量（2×10¹² vg/kg）和高剂量（4×10¹² vg/kg）两个队列，并在GS001输注前一周开始接受预防性泼尼松或泼尼松联合他克莫司治疗。中位随访时间分别为156.0周和110.5周。研究主要评估了FVIII活性、年化出血率、不良事件以及细胞和体液免疫反应。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《血友病A的I期试点研究：使用AAV8载体并辅以预防性他克莫司-糖皮质激素治疗可获得治疗所需的FVIII活性》Phase 1 pilot study for hemophilia-A: AAV8 vector with prophylactic tacrolimus-glucocorticoid achieves therapeutic FVIII activity
发表期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影响因子：52.7
研究背景：
血友病A是由凝血因子VIII缺乏或功能障碍引起的X连锁遗传性出血性疾病。当前标准预防治疗因经济等原因在中国尚未普及，患者未满足的医疗需求巨大。AAV载体基因疗法是血友病治疗的重要平台，但仍面临肝毒性、宿主免疫反应以及FVIII转基因表达持久性不佳等挑战。
研究思路：
- 试验设计
采用剂量递增设计，先进行低剂量组试验，安全评估后进行高剂量组。 - 参与者
招募重度血友病A（FVIII:C <1 IU/dL）成年男性，无FVIII抑制物史，AAV8中和抗体滴度≤1:16。 - 干预措施
单次静脉输注GS001。所有参与者从输注前一周开始预防性使用泼尼松。从第4名参与者开始，在泼尼松基础上加用他克莫司（约0.03 mg/kg/天），持续约5个月。 - 评估指标
主要评估安全性（不良事件、ALT/AST升高、载体脱落）。次要评估疗效（FVIII:C水平、ABR、FVIII用量）。通过ELISpot、流式细胞术和单细胞RNA测序分析免疫反应。
研究亮点：
- 疗效显著
高剂量组（4×10¹² vg/kg）所有6名参与者在第104周时FVIII活性均维持在29 IU/dL以上，达到非血友病状态（>40 IU/dL）或轻度血友病水平。 - 临床获益明确
两个剂量组的年化出血率（ABR）和FVIII年化消耗量均较基线显著下降。高剂量组患者在输注后未发生需要外源性FVIII治疗的出血事件。 - 免疫抑制策略有效
与单独使用泼尼松相比，联合使用他克莫司的参与者FVIII活性上升更快、峰值更高。体外实验证实他克莫司能特异性抑制活化CD8+ T细胞的增殖。 - 机制探索深入
通过单细胞RNA测序，发现干扰素-α通路相关基因（如DDIT4, IRF7）在CD8+ T细胞中的上调可能与后续FVIII水平下降相关，为监测和干预提供了潜在新靶点。
研究结果：
FVIII活性：
-
转基因表达在输注后5-7周达到峰值。 - 低剂量组
第144周时，中位FVIII活性为5.6 IU/dL（范围：0.5-52.0）。 - 高剂量组
第104周时，中位FVIII活性为42.7 IU/dL（范围：29.4-92.1），所有6名参与者FVIII水平均持续高于29 IU/dL。 -
联合使用他克莫司的参与者（低剂量组4-6号），其FVIII活性上升更快，平均水平在144周内持续更高。 临床获益：
- 年化出血率（ABR）
低剂量组从平均14.2降至2.6；高剂量组从平均13.0降至0.2。 - FVIII年化消耗量
低剂量组从平均1654.7降至246.8 IU/kg/年；高剂量组从平均799.7降至53.8 IU/kg/年。 -
高剂量组无人在GS001输注后发生需要外源性FVIII治疗的出血事件。 安全性：
-
最常见治疗相关不良事件是ALT升高（低/高剂量组分别有3/6和5/6参与者），多数为1-2级。 -
未报告血栓栓塞事件、死亡或导致退出研究的治疗相关不良事件。 -
所有参与者均报告了糖皮质激素相关不良事件（如白细胞计数升高、痤疮），他克莫司相关不良事件（如短暂血肌酐升高）见于6/12参与者。 免疫反应分析：
-
所有参与者均在输注后一周内产生高滴度AAV中和抗体，并持续存在。未检测到FVIII抑制物。 - 体外实验
他克莫司能显著抑制来自参与者的活化CD8+ T细胞增殖，对CD4+ T细胞影响不大。 - 单细胞RNA测序
：泼尼松联合他克莫司的预处理有效抑制了两个队列参与者CD8+ T细胞中的炎症、IFN-γ和TNF-α信号通路。干扰素相关基因（如DDIT4， IRF7）在CD8+ T细胞中的表达上调可能与FVIII水平下降阶段相关。
研究总结：
- 结论
GS001输注在重度血友病A患者中安全且耐受性良好，能够快速达到接近正常的FVIII:C水平，并在两年内维持在临床相关水平。通过整合高效表达盒和预防性联合使用糖皮质激素与他克莫司，GS001显著减少了参与者的出血事件和FVIII使用量。 - 讨论
-
预防性使用泼尼松和他克莫司可有效减少特异性T细胞反应，有助于减轻AAV输注诱导的免疫反应，可能增强转基因表达。 -
CD8+ T细胞中干扰素-α通路相关基因可能作为AAV输注诱导特异性免疫反应的监测和干预新靶点。 - 局限性
随访时间相对较短；免疫监测有限；缺乏对照队列限制了直接的疗效比较；高剂量组FVIII活性在两年后的持久性仍有待长期随访数据评估。 -
该研究的疗效正在III期研究（NCT06833983）中进一步验证。
结果译文：
1.受试者招募及A型血友病AAV输注剂量
2021年3月至2023年5月期间，共筛选了40名重型血友病A受试者。最终，12名受试者被纳入两个剂量队列（低剂量队列2×10¹² vg/kg组6人，高剂量队列4×10¹² vg/kg组6人；图1）。受试者的人口学和基线特征见表1和补充表1。受试者平均年龄为27.7±8.0岁（表1）。入组前，9名受试者曾接受低剂量FVIII预防性治疗。筛选前，这些受试者的平均（±标准差，SD）年化出血率（ABR）为12.1±5.3。3名受试者曾接受按需FVIII治疗。两个队列受试者的平均年龄、身高和体重相似。低剂量队列的中位（范围）/平均（±SD）随访时间为156.0周（144.0-208.0周）/167.5±27.1周；高剂量队列为110.5周（104.0-130.0周）/114.8±12.8周。所有入组受试者均纳入安全性分析集（SAS）、全分析集（FAS）和药效动力学分析集（PDS）。
2.GS001基因治疗对重型血友病A的基因递送和表达效率（一期凝固法）评估
3.GS001输注的两个剂量均显著减轻血友病A受试者的症状
在低剂量队列中，GS001输注后第3周至截止日期的中位（范围）/平均（±SD）ABR从11.0（7.0-30.0）/14.2±9.3次事件降至0.8（0-10.0）/2.6±3.9次事件（图3a）；在高剂量队列中，从12.5（8.0-20.0）/13.0±4.6降至0（0-0.5）/0.2±0.2次事件（图3b）。FVIII的年化消耗量中位（范围）/平均（±SD）在低剂量队列中从1184.0（280.0-4524.0）/1654.7±1573.4显著降至177.0（0-556.0）/246.8±259.3 IU/kg/年（图3c）；在高剂量队列中从650.0（92.0-1612.0）/799.7±628.1降至0（0-316.0）/53.8±128.6 IU/kg/年（图3d）。高剂量队列中无受试者在GS001输注后出现需要外源性FVIII治疗的出血事件。两名受试者因关节置换术接受低剂量FVIII预防性治疗。在高剂量队列中，一名受试者在载体输注后53.0周维持FVIII:C为109.0 IU/dL，随后在无FVIII替代治疗的情况下进行了右膝关节置换术、右髋关节置换术和左膝关节置换术。在两个队列中，所有接受预防性FVIII治疗的受试者在基因治疗后均停止使用FVIII。
4.严重HA患者中GS001基因治疗的AE评估
5.两个剂量队列中GS001输注诱导的体液和细胞免疫应答评估
6.治疗浓度的他克莫司在体外抑制GS001输注受试者活化CD8+ T细胞的增殖，但不抑制CD4+ T细胞
为了进一步理解他克莫司在血友病A基因治疗中的免疫抑制角色，我们分析了治疗后一周来自受试者8-11的外周血PBMC。PBMC用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记，用抗CD3/28磁珠活化，并用不同剂量的他克莫司处理。72小时后，使用流式细胞术评估T细胞活力、亚群比例和增殖（图4a）。培养后，细胞用CD4/CD8抗体染色，并测量CFSE以评估T细胞亚群增殖（图4b）。测试了不同他克莫司剂量对受试者PBMC培养物的毒性，100 μg/mL显示出显著细胞毒性，而10 μg/mL和1 μg/mL无毒性（图4c）。在随后的免疫抑制实验中，使用1 μg/mL他克莫司研究其对T细胞增殖的影响。流式细胞术结果（图4d）显示，他克莫司显著降低了CD8+ T细胞的比例，对CD4+ T细胞影响最小。CFSE水平分析显示，他克莫司显著抑制了活化CD8+ T细胞的增殖，对CD4+ T细胞增殖无显著影响（图4e）。
7.GS001输注前后PBMC的单细胞RNA测序及分析鉴定出CD8+ T细胞中的I型干扰素通路作为特异性T细胞免疫检测和干预的潜在靶点
我们对8名受试者在四个时间点的PBMC进行了单细胞RNA测序，整合数据并使用统一流形逼近与投影（UMAP）进行降维和聚类，以识别免疫细胞亚群（图5a）。在第3天和第28天，T/NK细胞的百分比低于第0天，而PBMC中单核细胞和B细胞在第3天和第28天的百分比高于第0天（图5b）。与第-7天相比，两个队列CD8+ T细胞中炎症（人类基因集M5932）、IFN-γ（人类基因集M5913）和TNFA via NFkB（人类基因集M5890）的富集评分被泼尼松联合他克莫司预处理显著抑制，仅在载体输注后第28天IFN-α评分（人类基因集M5911）略有增加（图5c）。CD8+ T细胞（第3天和第28天 vs. 第0天）的差异基因表达分析确定了前导候选基因（图5d；补充表7），包括干扰素相关基因如DDIT4、IRF7、CD81、ISG15、PCBP1、RBM38、JUND和STAT2。定量聚合酶链反应（qPCR）验证证实了它们的下调，当将4名受试者（受试者5-8）的样本分为FVIII上升期（第3-7周）和下降期（第8-12周）时，这些下调与FVIII:C的下降相关（图5e；补充表8-9）。单细胞RNA分析表明，泼尼松联合他克莫司预处理有效抑制了两个队列受试者中的CD8+ T细胞免疫反应。此外，它还识别了用于监测和干预的潜在新标志物。
更多结果和补充图表：doi：10.1038/s41392-026-02599-3
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