2区4.9分！单细胞转录组学公共数据库挖掘与CellChat生信分析揭示：IFN-I相关T细胞抑制NK细胞活化，治疗白塞病葡萄膜炎的免疫调控新机制！

白塞病葡萄膜炎是导致失明的重要原因，但干扰素α-2a为何能有效治疗部分难治性患者，其免疫学机制一直不清。本研究通过单细胞转录组学（scRNA-seq） 与批量RNA-seq的联合生信分析，并结合CellChat细胞通讯网络分析，首次揭示了一群关键的CD4+ IFN-I相关T细胞（高表达IFI44L、MX1、ISG15等干扰素刺激基因）在活动期患者外周血中显著减少，经IFNα-2a治疗后又得以恢复。更关键的是，通过hdWGCNA共表达网络分析和SCENIC转录因子预测，发现该细胞亚群受STAT2转录因子的调控，并能通过LLT1-CD161配体-受体对直接抑制NK细胞的炎症活性。体外实验证实，阻断CD161受体可完全逆转CD4+ IFN-I相关T细胞对NK细胞的抑制效应。这一发现不仅解开了IFNα-2a治疗白塞病的“黑箱”之谜，更将LLT1-CD161免疫检查点轴确立为葡萄膜炎治疗的潜在新靶标。

今天给大家解读一篇4月发表在《Biology Direct》上的题目为“Single-cell analysis highlights the role of CD4+ IFN-I-related T cells in Behcet's uveitis during Interferonα-2a therapy.”的文章。本研究旨在探讨IFNα-2a通过免疫细胞调节治疗BD的机制。通过整合自身和公共scRNA-seq数据，构建了活动性BD患者、治疗4个月后BD患者、活动性BD患者及健康对照者的PBMCs单细胞图谱，并对CD4⁺ T细胞进行批量mRNA测序验证。结合细胞互作、共培养及抑制剂实验，发现CD4⁺ IFN-I相关T细胞在活动性BD中减少、治疗后恢复，并通过LLT1-CD161相互作用抑制NK细胞活化和IFN-γ分泌。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！

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团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
       
       
       

        
       
       
       

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CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

1. 数据整合与分析
   整合自建和公共scRNA-seq数据，构建PBMCs单细胞图谱，比较活动性BD患者、治疗后BD患者、活动性BD患者及健康对照者的细胞组成。
2. 验证
   对活动性BD患者和健康对照者的CD4⁺ T细胞进行批量mRNA测序以验证关键发现。
3. 机制探索
   利用细胞间相互作用分析、体外共培养及抑制剂实验，探究CD4⁺ IFN-I相关T细胞与NK细胞之间的相互作用及其下游效应。

研究亮点：

1. 整合自建和公共单细胞RNA测序数据，构建了涵盖活动性BD患者、治疗后BD患者及健康对照者的外周血单核细胞（PBMCs）单细胞图谱。
2. 通过细胞间相互作用分析、体外共培养及抑制剂实验，揭示了CD4⁺ IFN-I相关T细胞与NK细胞之间的LLT1-CD161信号轴。
3. 结合批量mRNA测序对CD4⁺ T细胞进行验证，增强了结果的可靠性。

研究结果：

1. CD4⁺ IFN-I相关T细胞（以高干扰素相关基因表达为特征）在活动性BD患者中显著减少，但在IFNα-2a治疗后恢复。
2. 活动性BD中，CD4⁺ IFN-I相关T细胞与NK细胞之间的LLT1-CD161相互作用强度降低，治疗后恢复。
3. CD4⁺ IFN-I相关T细胞通过CD161受体抑制NK细胞的活化和IFN-γ分泌。

研究总结：

结果译文：

研究设计如图1a所示。我们收集了3例活动性BD患者的PBMC，并在IFNα-2a治疗4个月后再次获取其PBMC，然后进行10× Genomics平台单细胞RNA测序。为提高统计效力，我们将这些数据与来自活动性BD患者和HCs的PBMC公开scRNA-seq数据集（GSE198616）进行整合。

总的来说，我们的单细胞PBMC图谱共包含7例活动性BD患者、3例IFNα-2a治疗后BD患者和4例HCs。另一个来自9例aBD患者和10例HCs的公开PBMC批量测序数据集（GSE198533）被纳入分析。CD4+ IFN-I相关T细胞的特征和比例通过多种生物信息学分析进行描述。为进行验证，我们对从4例活动性葡萄膜炎BD患者和4例HCs分选的CD4+ T细胞进行了批量RNA-seq。我们还对来自4例BD患者和4例对照个体的皮肤样本的公开批量RNA-seq数据集进行了差异基因表达分析。额外收集了31例HCs、28例活动性BD患者和23例IFNα-2a治疗后BD患者的样本用于流式细胞术和免疫荧光检测。通过Cellchat分析和体外抑制剂实验，探究了CD4+ IFN-I相关T细胞通过CD161对NK活性的抑制效应。

为探究参与活动性BD的重要细胞类型，我们首先对scRNA-seq数据进行了WGCNA。选择了软阈值功效（图S2a）。计算并可视化了聚类树状图（图2a）。具体识别出七个模块，并在PBMC细胞类型中识别了各模块的表达水平（图S2b和图S2d）。图S2c展示了每个模块中富集的前10个基因。干扰素刺激基因（包括IFI30、IFI44L、ISG15和MX1）在模块2中的富集将其归类为干扰素相关模块（图2b）。为探究表达干扰素相关模块的细胞类型与BD活动性之间的关系，各组根据疾病活动性从1到3排序，其中1：HC；2：IFNα-2a治疗后的BD患者；3：活动性BD患者。我们评估了疾病活动性与PBMC细胞类型中每个模块之间的关系。如图2c中的热图所示，模块2在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中与疾病活动性呈显著负相关，在CD16+单核细胞和CD14+单核细胞中与疾病活动性呈正相关。这一结果提示，干扰素相关模块在T细胞中的表达与BD活动性呈负相关，这可能是IFNα-2a在BD中疗效的一个原因。

如上所述，我们发现活动性BD患者中T细胞亚型的比例发生显著变化。我们进一步从PBMC单细胞测序数据中提取T细胞数据，并对T细胞亚群进行重聚类。重新组合为19个簇，并通过标记基因识别每个细胞类型（图S3a和图3a），包括用于区分CD8+ T细胞与CD4+ T细胞的CD3D和CD8A，用于幼稚T细胞的CCR7，用于CD8+效应T细胞的GZMK和GZMB，用于CD8+ STAT5A细胞的STAT5A，用于NKT细胞的NCR1，用于增殖T细胞的MKI67，用于CD4效应记忆细胞的GZMK，用于CD4+ Th17细胞的IL17RA，用于CD4+ Th2细胞的GATA3，用于CD4 Th1细胞的TBX21，以及用于CD4+ IFN-I相关T细胞的IF16、ISG15、IFI44L和MX1（图3b和图S3b）。我们还可视化了每个T细胞亚型中上调最显著的前5个基因（图S3c）。

特异性标志基因IFI44L和MX1被用于在扩展样本中鉴定CD4+ IFN-I相关T细胞。通过流式细胞术分析纯化的CD4+ T细胞，以检测带有MX1阳性标志物的CD4+ IFN-I相关T细胞（图4a）。结果显示，与HCs相比，活动性BD患者CD4+ T细胞中MX1阳性频率显著降低（P = 0.0001），且在IFNα-2a治疗后显著增加（P < 0.0001, 图4b）。流式细胞术与scRNA-seq显示这些T细胞的比例相似。此外，我们通过FACS从3例HCs的PBMC中分选出CD4+MX1+ T细胞。与PBMC中的其他细胞（CD4+MX1+、CD4+MX1-、CD4+MX1-细胞）相比，通过qPCR检测了CD4+MX1+ T细胞中标志基因IFI44L、MX2、IFI6和ISG15的相对表达。IFI44L、MX2、IFI6和ISG15的相对表达在CD4+MX1+ T细胞中显著高于PBMC中的其他细胞（图4c）。这些结果证明了CD4+MX1+ T细胞的标志基因展现了与scRNA-seq识别相同的特征。

在进一步研究中，我们重点表征了已识别的CD4+ IFN-I相关T细胞。进行UCell分析以评估所有T细胞亚组中标志基因集的变化。我们对CD4+ IFN-I相关T细胞进行了GSVA，并可视化了标志基因集中的通路。结果显示，该亚型中TNF-α/NF-κB和PI3K/AKT/MTOR信号通路的表达下调（图5a）。根据I型IFN富集评分的定量，该亚型被鉴定为CD4+ T细胞亚组中增加最显著的亚组（图5b和图5c, P < 2×10e-6）。此外，I型IFN富集评分在aBD组中显著降低，但在IFNα-2a治疗后增加（图5d, P = 8×10e-8）。这些结果表明，CD4+ IFN-I相关T细胞展现出部分抗炎效应和对干扰素的强烈反应。

细胞-细胞相互作用的失调是一个关键的致病因素，且可能被用作多种自身免疫性和自身炎症性疾病的治疗靶点。我们进一步探究了PBMC中配体和受体之间可能发生改变的细胞-细胞相互作用对。Cellchat分析揭示了在HCs、活动性BD患者和IFN-2a治疗后BD患者中，CD4亚型与PBMC中主要细胞类型之间不同相互作用对的相互作用强度（图S5a）。值得注意的是，CLEC2D-CD161通路被发现于活动性BD患者中减弱，并在IFN-2a治疗后的BD患者中恢复（图6a）。为识别活动性BD患者中NK细胞的生物学特征，我们对scRNA-seq数据中活动性BD患者相较于HCs的NK细胞上调的DEGs进行了GO分析。结果显示，来自活动性BD患者的NK细胞显著参与“免疫反应激活信号通路”、“免疫反应激活”、“肿瘤坏死因子产生的调控”和“肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生”（adj. P < 0.05, 图6b）。我们验证了5例活动性葡萄膜炎BD患者和5例HCs的NK细胞中IFN-γ和TNF-α的表达水平。rt-qPCR的结果显示，来自活动性葡萄膜炎BD患者的NK细胞中IFN-γ和TNF-α的表达水平相较于来自HCs的NK细胞显著上调，与scRNA-seq数据中的结果一致（图S5b）。基于这些发现，合理推测CD4+ IFN-I相关T细胞可能通过CLEC2D-CD161相互作用抑制NK细胞的活性。

更多结果和补充图表：doi：10.1186/s13062-026-00810-7

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