今天给大家解读一篇3月发表在《Cells》上的题目为“Acute Depletion of Cited2 in Embryonic Stem Cells Disrupts Gene Networks Controlling Self-Renewal, Homeostasis, and Early Cell Fate Commitment.”的文章。本研究利用可诱导敲除的小鼠胚胎干细胞模型，通过急性耗竭Cited2，结合转录组学、分子生物学和细胞生物学方法，全面阐述了Cited2在维持ESC多能性、稳态和发育能力中的核心作用。研究发现Cited2缺失导致多能性网络解体、Nodal/Activin信号输出受损、DNA损伤反应基因下调以及p53/HIF等应激通路上调，最终引发自发分化和细胞存活率下降。文章将细胞表型与分子机制及已知的胚胎发育缺陷相联系，深化了对Cited2在早期发育中功能的理解。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《胚胎干细胞中Cited2的急性耗竭扰乱了控制自我更新、稳态和早期细胞命运决定的基因网络》Acute Depletion of Cited2 in Embryonic Stem Cells Disrupts Gene Networks Controlling Self-Renewal, Homeostasis, and Early Cell Fate Commitment
发表期刊：Cells
影响因子：5.2
研究背景：
- Cited2的重要性
Cited2是一种关键的转录调控因子，对于脊椎动物的胚胎发育和细胞稳态至关重要。在人类中，CITED2变异与先天性心脏病相关。 - 分子功能
Cited2能与转录共激活因子p300/CBP高亲和力结合，通过竞争性结合或干扰其乙酰化活性，调控多种转录因子（如HIF1α、NF-κB、p53、Smad2/3等）的活性，从而整合多种信号通路。 - 在ESC中的已知作用
在小鼠ESC中，Cited2和p300/CBP在平衡多能性维持和细胞命运决定中发挥复杂作用。Cited2过表达足以在无LIF条件下维持自我更新，而其急性缺失则导致增殖/存活受损并伴随自发分化。
研究思路：
- 模型构建
使用携带CreERT2的Cited2条件性敲除小鼠ESC系（C2fl/fl[Cre]），通过4-羟基他莫昔芬（4HT）处理实现Cited2的急性、特异性耗竭。 - 表型与机制解析
- 转录组全景分析
对Cited2耗竭后48小时（未分化条件下）的ESC进行微阵列分析，鉴定差异表达基因（DEG）。 - 关键通路验证
通过报告基因实验、qRT-PCR验证对Nodal/Activin信号通路、多能性/分化标志物、p53靶基因等的影响。 - 功能关联分析
进行基因富集分析（GO、ChEA），并与已发表的p300、CBP缺失数据交叉比较，明确Cited2特异性调控网络。 - 细胞表型与机制探索
通过检测γH2AX评估DNA损伤，使用pifithrin-α抑制p53评估其在细胞死亡中的作用，通过ChIP检测组蛋白修饰（H3K27me3/H3K27ac）的变化。 - 体内相关性验证
在胚胎大脑特定区域敲除Cited2的模型中，验证部分在ESC中受影响的神经发育相关基因的表达变化。
研究亮点：
- 系统性
采用急性耗竭模型结合转录组学（微阵列）分析，系统描绘了Cited2缺失后ESC的早期转录全景变化。 - 机制深入
不仅描述了表型（自发分化、细胞死亡），还深入探讨了对Nodal/Activin信号通路输出、DNA损伤反应、p53/HIF应激通路以及组蛋白修饰（H3K27me3/H3K27ac）的潜在影响。 - 对比清晰
通过与p300、CBP缺失数据的对比，明确了Cited2功能的独特性，指出其并非p300/CBP的全局转录放大器，而是在特定发育基因节点上起选择性缓冲作用。 - 桥梁意义
将ESC中发现的基因调控网络（如心脏、神经发育相关基因下调）与Cited2缺失小鼠胚胎的发育缺陷表型直接关联，为理解其发育生物学功能提供了细胞机制解释。
研究结果：
- 转录组剧烈变化
Cited2急性耗竭48小时后，共鉴定出399个差异表达基因（168个上调，231个下调）。 - 多能性网络解体
下调基因显著富集于OCT4、SOX2、NANOG等多能性核心因子的靶基因。关键多能性因子Nanog、Tbx3、Klf4表达下降。 - 关键发育信号通路受损
- Nodal/Activin通路
关键靶基因 Lefty1、Lefty2、Pitx2 显著下调。报告基因实验证实Smad2/3-Foxh1依赖的转录活性降低。Cited2可作为该通路的共激活因子。 - Wnt通路
推测经典Wnt信号可能被过度激活（基于抑制因子Dkk1等下调及LEF1靶基因上调）。 - 分化程序紊乱
在未分化条件下，早期中胚层（Mesp1， Kdr， Isl1）和谱系标志物（Dkk1， Cdx2）异常上调，表明出现自发、无序的分化，而非正常的定向分化。 - 应激与基因组稳定性破坏
- DNA损伤反应
多个DNA修复和同源重组相关基因（如 Rad51c， Mdc1）表达下调。 - 应激通路激活
p53靶基因（如 Plk2， Hmox1）和HIF1α靶基因表达上调。细胞内ROS水平增加，γH2AX焦点强度增强。 - 部分依赖p53
低剂量p53抑制剂pifithrin-α能部分挽救Cited2耗竭导致的细胞数量减少。 - 代谢与免疫相关基因下调
多种氨基酸转运蛋白基因和干扰素反应相关基因（如 Ifitm1， Ifitm3）表达降低。 - 与p300/CBP功能的对比与关联
- 有限重叠
Cited2缺失的转录谱与p300或CBP缺失谱重叠度很低，表明Cited2并非其全局辅助因子。 - 共享节点
重叠部分主要集中于少数发育相关基因（如 Lefty1/2）和应激/免疫相关基因。 - 无协同效应
共转染实验显示，Cited2与p300或CBP在激活Nanog启动子上无叠加或协同作用。 - 组蛋白乙酰化
Cited2耗竭后全细胞裂解液的组蛋白乙酰转移酶活性略有增加，但p300免疫沉淀物的活性未变。对特定基因启动子（如Wnt5a）的H3K27ac水平影响有限。 - 体内验证
在胚胎大脑特异性敲除Cited2的模型中，部分在ESC中下调的神经相关基因（Bmi1， Enpp2， Nav2， Zic5）表达未变，提示其在ESC中的下调可能是多能性退出后的间接后果。
研究总结：
- 核心结论
Cited2是维持ESC身份的核心调节因子，其功能是整合多能性维持、信号通路输出和应激反应控制。它通过一个“选择性转录缓冲程序”来保障发育能力。 - 作用机制
-
Cited2通过维持核心多能性网络和Nodal/Activin等关键发育信号通路的有效转录输出，来支持自我更新和正确的谱系启动。 -
通过维持DNA修复基因表达和抑制ROS、p53、HIF等应激通路，来保护基因组完整性并防止过早的细胞死亡或分化。 -
其缺失导致的多能性崩溃、应激激活和分化程序紊乱共同造成了发育潜能丧失。 - 功能独特性
Cited2的功能不能简单地等同于p300/CBP的辅助因子。它在ESC中调控一个独特的基因网络，与p300/CBP仅在特定发育和应激节点上存在交集。 - 发育意义
ESC中受Cited2调控的许多基因（涉及心脏、神经、胎盘发育）与Cited2缺失胚胎的缺陷表型直接对应，从而在细胞水平上解释了其胚胎致死性和多组织发育异常的分子基础。研究提示Cited2可能在协调早期胚胎的营养摄取、应激抵抗和免疫防御方面具有更广泛作用。
结果译文：
1.在未分化ESC中，Cited2耗竭破坏多能性相关转录和应激保护程序
我们之前已证明，在支持多能性和自我更新的培养条件下，小鼠ESC中Cited2的急性耗竭会诱导自发分化和细胞死亡[35]。为了阐明ESC中Cited2耗竭引起的细胞异常背后的分子机制，我们进行了基于微阵列的转录谱分析，以比较在支持自我更新的条件下培养的小鼠 C2fl/fl[Cre] ESC，经4-羟基他莫昔芬（4HT）处理48小时以耗竭Cited2，或经乙醇（溶剂）处理作为表达正常水平Cited2的对照细胞后的基因表达谱，如前所述[15,35]。为简化文本，这些条件将被称为第0天（D0）乙醇或4HT。还将基因表达模式与先前报道的分化第4天（D4）的Cited2耗竭细胞中的差异表达基因（DEG）进行了比较[15]，这些细胞是在与D0样本相同的条件下同时产生的。主成分分析（PCA）显示，在分化D4时，经4HT处理的细胞（Cited2耗竭细胞）的基因表达谱与未分化的对照ESC聚类更接近，而不是与分化D4的对照细胞聚类（图1A）。有趣的是，在支持自我更新的D0培养条件下，Cited2耗竭细胞（先前显示会自发分化[35]）的基因表达谱与分化D4的对照细胞不同（图1A）。因此，Cited2是ESC分化过程中正确转录轨迹所必需的，它的缺失导致了既不完全多能也不适当分化的异常基因表达状态。我们通过重点关注表现出显著差异表达（校正后 p 值 < 0.05）且 log2 倍数变化 > 1 或 < -1 的转录本来分析基因表达谱。通过比较对照ESC与在自我更新培养条件下培养的4HT处理细胞来分析DEG（表1和表S1）。在Cited2耗竭的细胞中，相对于对照ESC，有168个基因上调，231个基因下调（图1B）。
对Cited2耗竭细胞（D0）中下调基因的基因集富集分析使用Enrichr进行[43,44]。在Enrichr中，针对来自ChEA 2022的转录因子靶基因集测试了下调基因（补充表S1）。许多下调基因显著富集于核心多能性转录因子Oct4、Sox2和Nanog，以及辅助因子Klf2、Klf4、Klf5、Smad3和Tcf3的靶标（补充表S2A）。这些观察结果表明，Cited2耗竭优先影响与多能性调控网络相关的基因，这与我们之前的研究一致，该研究表明Cited2对于维持小鼠ESC的自我更新是必需的，并通过募集到Nanog、Tbx3和Klf4的调控区域来促进Nanog表达[35]。
此外，排名靠前的下调基因包括Lefty1和Lefty2（图1B和补充表S1），它们在维持ESC多能性与分化平衡、左右模式形成以及胚胎心脏和神经发育中起着至关重要的作用[50-52]。此外，T/Brachyury（编码泛中胚层标记物，我们之前已证明在ESC分化过程中，其在Cited2耗竭细胞中表达下调[15,53]）和Pitx2（小鼠胚胎中Cited2的直接靶基因，编码一种转录因子[2]），也是Cited2耗竭ESC中下调最多的基因之一（表1和S1）。Lefty1、Lefty2和Pitx2是Nodal/Activin信号通路公认的直接靶标，通过转录因子Smad2、Smad3以及与Foxh1合作被激活[54]。
此外，已知Cited2作为Smad2/Smad3的转录共激活因子[55]，暗示其在调节小鼠ESC中该通路转录输出中的潜在作用。基于这些观察，我们假设Cited2耗竭损害了ESC对Nodal/Activin信号的转录响应能力，而不是影响通路本身的上游激活。
为了评估Citeded2是否通过共激活Smad2/Smad3和Foxh1参与Nodal/Activin通路活性，我们在Cited2耗竭和对照ESC中进行了瞬时转染实验，使用(ARE)3-lux荧光素酶报告基因[56]。该报告基因包含在来自爪蟾属的activin即刻早期基因启动子的三个串联activin响应元件控制下的荧光素酶基因。(ARE)3-lux专门设计用于测量TGF-β/Activin/Nodal通路下游的Smad2/Smad3-Foxh1依赖性转录活性。值得注意的是，在Cited2耗竭的细胞中，(ARE)3-lux活性显著降低（图1C），表明在缺乏Cited2的情况下，Smad/Foxh1依赖的转录输出受损。
为了进一步研究TGF-β/Activin/Nodal通路组分对这一转录反应的贡献，我们在E14TG2A小鼠ESC中进行了共转染实验。将(ARE)3-lux与编码flag-Smad2或flag-Foxh1的表达质粒共转染导致报告基因激活，其中Foxh1发挥了特别强的效应（图1D），这与其作为ESC中Smad2/Smad3依赖性转录的关键介质的角色一致。重要的是，flag-CITED2与flag-Smad2或flag-Foxh1的共表达进一步增强报告基因活性，支持CITED2在此背景下作为转录共激活因子的作用。添加外源性Activin A在所有共转染条件下都强烈增加了(ARE)3-lux活性，这与强通路激活一致。在这些条件下，外源性Smad2和CITED2的个体贡献不再明显，这可能反映了在多能干细胞中最大Activin/Nodal信号传导下，靶基因位点的Smad2/Smad3依赖性转录复合物达到饱和[57]。总之，这些发现表明，在Nodal/Activin通路下游，Cited2是有效转录激活Smad2/Smad3靶基因所必需的，而不是启动信号级联反应本身所必需的。因此，小鼠ESC中Cited2表达的减少限制了Smad2/Smad3在其靶位点的有效转录输出，导致典型靶标如Lefty1、Lefty2和Pitx2的表达下降。
基于我们之前发现Cited2在ESC分化过程中对中胚层和心肌细胞特化至关重要，我们通过qRT-PCR分析了在D0和D4时关键谱系标记物（Mesp1, Kdr, Isl1, Dkk1和Cdx2）的表达（图2A）。这些基因在D0的Cited2耗竭细胞中显著上调，表明过早或失调地激活了中胚层和早期谱系标记物，与我们之前的观察一致[35]。因此，与在胚状体（EB）介导的分化中观察到的有序进展（谱系标记物在严格控制的序列中被激活）不同，Cited2耗竭可能导致自发和不协调的分化。具体来说，Cited2的急性缺失可能导致在未分化条件下中胚层标记物（Mesp1, Kdr, Isl1）和早期谱系调节因子（Dkk1, Cdx2）的异常上调，突显出与EB过程分化不同的分化轨迹[15,35,39]。这种谱系标记物的过早表达加剧了多能性“守门”功能的崩溃，因为Cited2的缺失导致核心转录因子（包括Nanog, Klf4和Tbx3）的下调，这些因子对于维持多能状态至关重要[35]。此外，如微阵列分析所示，在D0的Cited2耗竭细胞中，许多下调基因也是其他多能性相关调节因子（如Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Klf4, Klf5, Smad3和Tcf3）的靶标，进一步强调了Cited2对维持多能性网络的广泛影响。此外，参与IFN反应的基因（Bst12, Ifitm1, Gbp2, Gbp3, Gbp7和Parp12）也下调（补充表S1）。最近的研究报道，CITED2通过抑制IRF1和STAT1（I型和II型IFN激活信号通路的关键介质）充当干扰素刺激基因（ISG）的负调节因子[25,26]。值得注意的是，受CITED2调节的NF-κB和STAT2也在IFN-β和ISG转录中分别发挥核心作用。
2.ESC中Cited2耗竭增加了与凋亡和分化程序相关的基因表达
3.未分化小鼠ESC中受Cited2、p300和CBP耗竭影响的基因的比较与分析
p300和CBP都是小鼠ESC中必需的转录共激活因子，通过组蛋白乙酰化（包括组蛋白H3赖氨酸27的乙酰化，H3K27ac）以及通过与转录因子相互作用促进增强子-启动子相互作用来调节多能性和谱系特化[32,33,35,36]。Cited2与p300/CBP功能上相互作用，并已涉足多个信号通路下游的转录反应，表明其在ESC生物学中既有共享的也有背景特异性的作用[68]。为了研究Cited2依赖性转录程序如何与小鼠ESC中由p300或CBP调控的程序相关联，我们将Cited2耗竭后的差异表达基因与已发表的p300或CBP耗竭小鼠ESC的转录组数据集进行了比较[34]。使用一致的基因符号协调和可比的差异表达阈值，我们观察到在这些实验条件下基因集之间的重叠有限。例如，Cited2耗竭后上调的基因中只有1.8%在p300或CBP耗竭的ESC中也上调，而所有三种条件下共享的下调基因占6%（表2）。这些共享的下调基因包括Lefty1和Lefty2，它们是典型的Nodal/Activin通路靶标和早期发育模式形成的关键调节因子，也是Cited2耗竭ESC中受影响最显著的转录本之一。值得注意的是，在Cited2和p300或CBP耗竭后共同下调的基因包括基于Enrichr ChEA-2022分析的核心多能性相关转录因子（如Tcf3, Nanog, Smad3, Oct4和Klf2/4/5）的靶标（补充表S4），表明汇聚在选定的调控节点上，而不是全局共调控。
4.CITED2调节超出p300 HAT活性的染色质乙酰化能力
5.Cited2缺失诱导应激相关转录程序并损害基因组维护
6.Cited2耗竭对ESC中H3K27甲基化和乙酰化状态的影响
更多结果和补充图表：doi：10.3390/cells15050450
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