今天给大家解读一篇3月发表在《EMBO Molecular Medicine》上的题目为“Dextrorotatory kynurenine suppresses acute rejection through inhibiting M1 macrophage-mediated inflammation.”的文章。本研究旨在探究右旋氨基酸，特别是D-Kyn，在肾移植急性排斥反应中的作用。通过分析患者血清、单细胞测序数据，并结合体外细胞实验与小鼠移植模型，研究发现D-Kyn水平与稳定的移植功能正相关。D-Kyn能通过PHGDH/TLR4/Caspase-1通路强力抑制M1巨噬细胞的炎症活性，并通过下调巨噬细胞来源的IL-23a来减少CD8+ T细胞的活化。动物实验证实，D-Kyn治疗能显著延长移植物存活并减轻排斥反应。文章提出D-Kyn是预防急性排斥的潜在治疗候选物。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
不想做实验，没数据，还想要快速发表文章，没问题的！公共数据库就是我们的数据宝藏！没思路不用担心，作为专业的生信团队，我们很乐意为你们效劳，提供研究路线设计和数据挖掘分析，扫码联系我们吧！
团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
题目：《右旋色氨酸抑制急性排斥反应，其机制是通过抑制M1型巨噬细胞介导的炎症》Dextrorotatory kynurenine suppresses acute rejection through inhibiting M1 macrophage-mediated inflammation
发表期刊：EMBO Molecular Medicine
影响因子：8.3
研究背景：
-
肾移植是终末期肾病的最佳疗法，但急性排斥（AR）仍是导致移植物长期丢失的主要挑战。 -
氨基酸在免疫调节中的作用日益受关注，右旋氨基酸（D-AAs）是具有生物活性的免疫调节化合物。 -
巨噬细胞，尤其是促炎的M1型，在驱动AR中扮演核心角色。 -
犬尿氨酸（Kyn）具有已知的免疫抑制特性，但其手性异构体D-Kyn与L-Kyn在调节巨噬细胞活性及AR中的具体作用和机制尚不明确。
研究思路：
- 临床发现
利用新型17β-EBC-IM-MS技术，对比分析AR患者与稳定患者的血清D-AA谱，发现D-Kyn比例在稳定组显著升高。 - 生物信息学关联
分析公共单细胞测序数据集（GSE109564），发现AR肾脏中M1型巨噬细胞高表达炎症因子IL-1β和犬尿氨酸酶（KYNU），提示Kyn代谢与M1巨噬细胞炎症存在潜在关联。 - 体外机制验证
-
在THP-1和RAW264.7细胞诱导的M1巨噬细胞中，验证D-Kyn比L-Kyn更能抑制炎症因子（IL-1β, IL-6）的mRNA和蛋白分泌。 -
通过RNA-seq、WB、ELISA、基因敲低、通路抑制剂和过表达实验，证实D-Kyn通过抑制ERK1/2/Fos通路下调PHGDH，进而抑制TLR4/NLRP3/Caspase-1轴的激活，最终减少IL-1β和IL-18的成熟与分泌。 -
发现D-Kyn能抑制巨噬细胞IL-23a的产生。 - 体内功能验证
- 皮肤移植模型
D-Kyn治疗可延缓排斥，减少移植物内M1巨噬细胞和CD8+ T细胞浸润，并降低血清IL-23a水平。 - 肾脏移植模型
D-Kyn治疗能减轻肾小管损伤、减少免疫细胞浸润、抑制移植物内巨噬细胞的TLR4/PHGDH/NLRP3通路激活，并降低CD8+ T细胞数量和活性。 - 对比与机制深化
直接对比显示D-Kyn效果优于L-Kyn；使用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞或使用抗IL-23a抗体，均可模拟D-Kyn的部分保护效应，证实其作用依赖于巨噬细胞及IL-23a介导的T细胞应答。
研究亮点：
- 临床相关性
首次在肾移植受者中发现，移植功能稳定者的血清D-Kyn比例显著高于发生AR的患者，提示其作为潜在生物标志物和治疗靶点的价值。 - 手性特异性
明确D-Kyn在抑制M1巨噬细胞炎症活性方面，其效果显著优于其对映体L-Kyn。 - 机制明确
从多个层面（临床、单细胞测序、体外、体内）阐明了D-Kyn通过PHGDH/TLR4/NLRP3/Caspase-1轴和ERK1/2/Fos通路发挥免疫抑制作用的分子机制。 - 多模型验证
研究同时在临床样本、小鼠皮肤移植和肾脏移植模型中验证了D-Kyn的免疫保护作用，增强了结论的可靠性。
研究结果：
- 临床样本分析
稳定肾移植患者血清中D-Kyn的比例显著高于AR患者。基于D-AA谱建立的模型能有效区分AR与稳定患者。 - 单细胞测序分析
AR肾脏中，高表达IL-1β的M1型巨噬细胞（Mac-1）也高表达KYNU，且细胞通讯分析显示Mac-1通过炎症通路与其他细胞活跃互动。 - 体外分子机制
-
D-Kyn比L-Kyn更有效地下调M1巨噬细胞炎症因子表达。 -
D-Kyn特异性下调PHGDH表达（通过抑制ERK1/2/Fos通路实现）。 -
D-Kyn抑制TLR4表达及NLRP3炎症小体激活、Caspase-1活化和IL-1β/IL-18的分泌。 -
敲低PHGDH可模拟D-Kyn的抑炎效果。 -
D-Kyn抑制巨噬细胞产生IL-23a。 - 体内动物实验
-
在皮肤和肾脏移植小鼠模型中，D-Kyn治疗均能显著延缓AR进程，改善移植物病理损伤，延长存活时间。 -
D-Kyn治疗组移植物内M1巨噬细胞浸润减少，其TLR4/PHGDH/NLRP3/Caspase-1通路被抑制。 -
D-Kyn治疗组移植物内CD8+ T细胞浸润和增殖减少，血清和局部IL-23a水平下降。 -
D-Kyn的免疫抑制效果优于L-Kyn。 -
清除巨噬细胞或阻断IL-23a，均可减轻AR并减少CD8+ T细胞浸润，印证了D-Kyn的作用途径。
研究总结：
结果译文：
1.肾移植受者的临床特征分析
共纳入23例病例，包括12例AR患者和11例移植后稳定患者，从总共25例患者中筛选。对包括年龄、性别、HLA分型、免疫抑制方案和肾脏来源在内的多个因素进行比较分析，未发现显著差异，如表1所示。23例患者的详细信息见表2。两名患者因病理检查证实的药物性肾损伤和低循环血量引起的肾前性损伤被排除。7名患者接受了环孢素+霉酚酸酯+泼尼松联合免疫抑制治疗，14例接受了他克莫司+霉酚酸酯+泼尼松治疗，其余2名患者接受雷帕霉素+霉酚酸酯+泼尼松方案。
2.肾移植中氨基酸的手性分析和相关性分析
利用基于离子淌度-质谱的新型方法，我们分析了血清样本中20种氨基酸和乳酸的D-AA/总-AA比例（图1A，表3和表4）。两组之间观察到Val、Leu、Phe、His、Trp和Kyn的右旋组成存在显著差异（表5）。稳定患者血清中D-Kyn比例显著升高，而AR患者中D-Val、D-Leu、D-Phe和D-Trp上调。相关性分析显示D-Leu、D-His、D-Trp和D-Phe之间存在强关联，尤其在AR组中。Kyn与AR和稳定组的分离显示出最高的相关性（图1B）。进行LASSO分析以鉴定对AR具有预测价值的氨基酸和临床因素（图EV1A），最终筛选出4种氨基酸：Met、Thr、Phe和Kyn。通过评估预测误差均方根确定模型的最佳组分数量，当组分数量设为1时观察到的RMSEP最低，其次是2和3个组分（图EV1B）。考虑到解释方差，选择具有三个组分的模型进行进一步PLS分析。PLS分析有效区分了AR患者和稳定肾功能患者（图1C）。使用DCA验证了我们预测模型的准确性（图1D）。此外，基于每个D-AA的个体水平开发了一个列线图模型来评估AR发生的风险（图EV1C）。
3.鉴定Kyn与AR中M1巨噬细胞的潜在相关性
鉴于M1巨噬细胞在介导AR中的新兴作用，我们通过分析GSE109564数据集中AR样本活检的scRNA-seq数据评估了巨噬细胞的作用。总共重新聚类并注释了16个亚簇（图2A,B和EV2）。每个簇的所有标志基因表达如图EV3所示。使用GSE109564数据库的数据在AR肾脏中鉴定出两个巨噬细胞簇。Mac-1以高水平炎症介质如IL-1β和CD83为特征，与M1炎症性巨噬细胞高度相似（图EV3）。在这两个巨噬细胞亚型之间观察到犬尿氨酸酶（KYNU，直接参与犬尿氨酸分解代谢的关键酶）和IL-1β表达的显著差异（图2C）。伪时间分析进一步突出了Mac-1和Mac-2分化轨迹的明显差异（图2D）。分析沿这些伪时间轨迹的KYNU和IL-1β表达，揭示了随着伪时间进展两者之间存在显著的正相关。使用Cellchat分析探索细胞通讯，揭示了AR中巨噬细胞、近端小管细胞、T细胞和内皮细胞之间的活跃相互作用（图2E）。发现Mac-1与Mac-2和内皮细胞相互作用（图2F）。鉴定了Mac-1的主要传入信号，包括与趋化因子和抗原呈递分子相关的通路（图2G）。Mac-1的传出信号在多种炎症通路中富集，如IL-1、IL-2和CD86。总之，这些结果表明在同种异体移植物排斥的背景下，Mac-1巨噬细胞主要通过炎症通路与各种细胞类型相互作用。此外，Mac-1可能在AR触发的免疫微环境下优先利用Kyn。
4.D-Kyn在抑制M1巨噬细胞炎症分泌方面比L-Kyn显示出更高的效力
鉴定出D-Kyn在非急性排斥组中持续上调，并显示出与AR和稳定组分离的最高相关性。已知Kyn通过AHR信号通路调节免疫抑制反应，该通路积极促进巨噬细胞中抗炎基因的表达。这使我们假设D-Kyn可能通过调节巨噬细胞与AR的发病机制功能相关。我们培养并诱导THP-1和RAW264.7细胞系分化为M1，并进一步用D-Kyn和L-Kyn处理。在用两种形式的Kyn处理的M1巨噬细胞中，观察到关键M1标志物在mRNA水平的显著下调，特别是IL-1β和IL-6（图3A,B），表明对M1介导的炎症的显著抑制。有趣的是，在用D-Kyn处理的两种细胞系的细胞培养基中，我们观察到显著更低的IL-1β蛋白分泌水平（图3C,D）。对处理的THP-1来源的M1巨噬细胞进行RNA-seq分析表明，M1和L-Kyn处理的细胞之间相似性更高（图3E）。相反，在M1和D-Kyn处理的细胞之间观察到明显差异，通过聚类分析证实（图3F）。通过分析差异表达基因，我们观察到与L-Kyn处理组相比，D-Kyn处理的巨噬细胞中PHGDH显著下调，PHGDH被确立为参与巨噬细胞分化的关键基因（图3G,H）。在体外D-Kyn处理的巨噬细胞中，mRNA水平验证了PHGDH的较低水平（图3I）。这些发现表明，与L-Kyn相比，D-Kyn可能通过PHGDH调节对M1巨噬细胞施加更强的免疫调节作用。
5.D-Kyn通过PHGDH/NLRP3/Caspase-1通路抑制M1巨噬细胞炎症分泌
如先前研究所记载，我们评估了巨噬细胞细胞系中的TLR4表达和调节。我们观察到TLR4表达较低，与PHGDH表达较低一致（图4A）。一致地，在Mac-1和Mac-2中观察到类似的PHGDH差异表达（图4B），进一步验证了PHGDH在AR背景下作为潜在的巨噬细胞分化因子。D-Kyn经验证可调节H3K27ac水平（图4C），如先前报道。在D-Kyn处理的巨噬细胞组中，与L-Kyn相比，我们观察到NLRP3和cleaved Caspase-1表达的显著下调（图4D）。此外，这些组中的Caspase-1活性显示出相似的模式。为了进一步证明PHGDH是否作为cleaved Caspase-1的上游调节因子，我们使用siRNA敲低PHGDH表达，导致cleaved Caspase-1表达沉默。PHGDH下调导致pNA浓度显著降低，反映Caspase-1活性降低（图4E）。PHGDH的缺失导致IL-1β mRNA水平降低（图4F）和更显著的IL-1β分泌减少（图4G）。为了研究D-和L-Kyn在抑制炎症分泌中的差异调节，我们培养了THP-1和原代BMDM细胞，并用MCC950处理以完全抑制NLRP3通路。在两种细胞类型中，L-Kyn处理组对IL-1β和IL-18的抑制更有效，MCC950处理后两种细胞因子均降至正常水平（图4H）。我们通过转染NLRP3质粒诱导NLRP3过表达，通过WB验证（图4I）。一致地，NLRP3过表达恢复了受抑制的IL-1β和IL-18分泌（图4J）。总之，这些发现表明，与其手性异构体L-Kyn相比，D-Kyn通过PHGDH/NLRP3/Caspase-1通路抑制M1巨噬细胞的炎症分泌。
6.D-Kyn通过ERK1/2/Fos通路抑制PHGDH表达
为了研究PHGDH mRNA的差异表达，我们筛选了显示出相似表达差异的转录因子。通过分析差异表达的转录因子，我们观察到Mac-1中FOS水平较高（图5A,B）。在不同浓度的D-Kyn处理下，我们观察到FOS蛋白表达的显著降低（图5C）。此外，其上游激活剂ERK1/2在磷酸化水平上显示出相似的模式。通过使用selumetinib（0.1 μM），一种选择性ERK抑制剂，体外显著降低了ERK磷酸化，导致FOS蛋白表达下降（图5D）。ERK抑制剂的应用降低了PHGDH mRNA水平（图5E）。我们进一步进行ChIP-PCR分析以研究Fos是否在体外与PHGDH的启动子区域结合。M1诱导显著增强了Fos与PHGDH启动子的结合，而D-Kyn处理部分抑制了这种结合（图5F）。通过WB分析，直接比较了D-Kyn和L-Kyn对ERK1/2磷酸化和FOS表达的影响。在THP-1细胞中，D-Kyn在抑制ERK1/2磷酸化方面显示出显著更高的效力（图5G）。在BMDM中观察到类似的抑制模式（图5H）。总之，这些发现证明D-Kyn通过ERK1/2/Fos通路抑制PHGDH表达。
7.D-Kyn通过减少M1和CD8 T细胞浸润增强小鼠皮肤移植中的移植物存活
小鼠全层皮肤移植，虽然其在人类中的应用有限，但仍然是广泛用于研究同种免疫反应和移植物排斥的成熟体内模型。我们利用该模型评估在肾功能稳定患者中观察到的D-Kyn水平升高是否发挥任何免疫抑制作用。注射D-Kyn显著推迟了急性排斥的进展，表现为移植物萎缩和炎性渗出减少（图6A），表明升高的D-Kyn水平对AR患者具有潜在的免疫抑制影响。移植后第14天的H&E染色显示，经历AR的同种异体移植物中角质层、皮脂腺和毛囊严重丢失。然而，D-Kyn治疗导致浸润免疫细胞和渗出显著减少（图6B）。皮肤移植物的总体存活表明，D-Kyn治疗显著改善了移植物排斥（图6C）。免疫荧光分析证实皮肤同种异体移植物中M1巨噬细胞的存在较高，而D-Kyn治疗显著逆转了这一点（图6D）。为了进一步研究D-Kyn是否影响免疫激活，收集每只小鼠的外周血并通过流式细胞术分析。到移植后第14天显著扩增的CD8 T细胞比例，在D-Kyn治疗后降至正常水平（图6E）。针对皮肤移植物中CD4和CD8 T细胞的IF分析显示移植物内CD4和CD8 T细胞丰度增加（图6F），但D-Kyn治疗显著降低了CD8 T细胞丰度。与CD8 T细胞活化相关的IL-23a在D-Kyn应用后也在血清中发现降低（图EV4A）。通过RNA-seq，我们在D-和L-Kyn处理的细胞中均观察到IL-23a的潜在下调（图EV4B），通过RT-qPCR分析验证（图EV4C）。此外，我们观察到D-Kyn处理的细胞中IL-23a的蛋白分泌水平降低（图EV4D）。我们在体内应用抗p40抗体阻断IL-23，导致移植物内CD8 T细胞浸润减少（图EV4E）。总之，这些发现表明D-Kyn可能通过调节IL-23a产生和抑制M1巨噬细胞介导的炎症来调节CD8 T细胞，从而增强同种异体移植物存活。
8.D-Kyn改善小鼠肾移植中AR的进展
诱导BLAB/C到C57BL6肾移植模型以进一步验证D-Kyn的免疫抑制特性。应用D-Kyn治疗AR对肾细胞没有明显的有害影响（图EV4F）。总体而言，D-Kyn治疗通过各种方式改善了小鼠肾移植中AR的进展。为了评估AR诱导的整体损伤，我们首先应用H&E分析。在D-Kyn治疗的小鼠的移植肾皮质内，发现浸润免疫细胞显著减少（图7A），伴随较轻的肾小管细胞损伤（图7B）。D-Kyn应用下调了肾脏NGAL（肾损伤标志物）以及整体TLR4和PHGDH的表达（图7C）。在D-Kyn治疗下，IL-1β和IL-18的分泌峰值被下调（图7D,E）。由CD86和iNOS的一致信号降低证明，D-Kyn治疗的AR肾脏中炎症巨噬细胞的丰度显著降低（图7F）。为了确定同种异体移植物浸润巨噬细胞中TLR4/ERK1/2磷酸化和NLRP3/Caspase-1表达的差异，我们应用F4/80磁珠从整个肾脏细胞中纯化巨噬细胞。与体外结果一致，我们在D-Kyn治疗组的F4/80阳性细胞中观察到TLR4、PHGDH、NLRP3和cleaved Caspase-1表达水平显著降低（图7G,H）。相应地，通过定量，我们在D-Kyn治疗组中观察到较低的ERK1/2磷酸化水平（图7I）。D-Kyn治疗组的CD4和CD8阳性细胞均减少，这可能与下调的巨噬细胞分泌的IL-23a水平有关（图7J）。为了检测IL-17分泌水平，我们应用了ELISA和WB分析。D-Kyn治疗下调了整个AR肾脏中IL-17的转录（图7K），在蛋白质水平上类似（图7L）。基于这些发现，D-Kyn通过抑制关键炎症通路，特别是通过TLR4/ERK1/2/NLRP3炎症小体轴的巨噬细胞活化，显著改善了小鼠肾移植中的急性排斥进展。此外，D-Kyn对T细胞发挥了全面的免疫抑制效应。
9.D-Kynurenine通过靶向巨噬细胞NLRP3炎症小体和IL-23a介导的T细胞反应，表现出优于L-异构体的免疫抑制效力
为了比较D-Kyn和L-Kyn之间的差异免疫抑制效力，我们将相同剂量的L-Kyn应用于移植的C57小鼠。肾小管损伤和整体淋巴细胞浸润在L-Kyn处理的AR组中仍然明显（图7A），进一步得到升高的NGAL水平支持（图EV4G）。Cleaved-Caspase-1被部分下调。然而，TLR4、PHGDH和总Caspase-1表达的整体降低不显著（图8A）。D-和L-Kyn处理组之间的直接比较表明，D-Kyn在NLRP3/Caspase-1表达方面发挥了更显著的下调作用（图8B），在ERK1/2磷酸化和Fos表达水平上类似（图8C）。为了验证T细胞免疫抑制是由浸润的巨噬细胞介导的，我们应用CL清除巨噬细胞。总体巨噬细胞清除减少了肾小管损伤、淋巴细胞浸润、CD8 T细胞增殖和GZMB活化（图7A,B和图8E,G,H）。此外，CL治疗阻止了TLR4/PHGDH表达增加和NLRP3/Caspase-1活化（图8E）。CL应用减弱了AR肾脏中F4/80以及炎症标志物CD86和iNOS的信号强度（图7F）。关于T细胞浸润，CD8 T细胞大大减少，而CD4 T细胞丰度保持不变（图7J），提示巨噬细胞浸润与CD8 T活化之间可能存在关联。相应地，CL治疗减少了Ki67+ CD8 T细胞，这在D-Kyn治疗组中较不显著（图8E）。鉴于观察到IL-23a来源于活化的巨噬细胞，我们应用抗IL-23a来验证免疫抑制效果（图8F）。阻断IL-23a减少了整体AR损伤，降低了CD4和CD8丰度，并逆转了浸润CD8 T细胞中GZMB的表达（图8G,H）。基于这些体内证据，D-Kyn通过靶向NLRP3/Caspase-1通路在抑制免疫反应方面比L-Kyn更有效。这种免疫抑制效应与浸润的巨噬细胞有关，因为清除它们减少了损伤和T细胞浸润，可能是通过抑制巨噬细胞来源的信号IL-23a实现的。
更多结果和补充图表：doi：10.1038/s44321-026-00377-w
扫描上方二维码或登录平台官网后添加CNSknowall客服微信咨询！官网地址：
https://cnsknowall.com
CNSknowall：24年最新问世的遥遥领先的科研数据（0代码生信+统计学）分析平台，同时含有机制图模块+汉化版Pubmed融合Deepseek高效筛选目标文献+SCI文献例句/语料检索模块+OPenAI官方GPT接口，＞500款CNS级别图表皆可一秒内一键出图，登录即秒变数据分析大神，体验前所未有的便捷数据分析之旅，开启科研天骄之路！
可向下滑动批阅！
