本研究在七例无关联汉族PCD家系中鉴定出ODAD1新型纯合移码变异c.705_706insGCAG及已知剪接变异c.-41-2A>C，患者均表现为典型慢性鼻窦炎、支气管扩张、内脏反位及极低鼻一氧化氮水平。利用患者鼻腔上皮气液界面培养结合高速视频显微镜、透射电镜及冷冻电镜，发现变异导致外动力臂及对接复合体完全缺失，纤毛摆动频率显著降低，且冷冻电镜进一步揭示c.705_706insGCAG变异导致A/B微管内异常密度及96 nm周期性复合体定位障碍。意外的是，ODAD1缺失还引起多纤毛细胞数量减少、基底体定向紊乱及顶膜面积代偿增大。定量蛋白质组学与免疫染色显示肌动蛋白细胞骨架显著重塑，F-actin异常成束贯穿上皮全层。细胞松弛素B抑制肌动蛋白聚合可部分恢复多纤毛细胞数量与纤毛发生，慢病毒回补野生型ODAD1则完全恢复外动力臂组装及协调摆动。该研究首次揭示ODAD1在纤毛轴丝结构与上皮细胞骨架完整性中的双重角色，为PCD提供了新的靶向干预策略。
今天给大家解读一篇3月发表在《Cell Discovery》上的题目为“Loss-of-function variants in ODAD1 disrupt ODA docking and induce actin cytoskeletal remodeling in primary ciliary dyskinesia.”的文章。本研究旨在深入探究ODAD1基因变异导致PCD的完整致病谱。通过对七名无关中国汉族PCD患者的遗传学分析，鉴定出两种ODAD1功能缺失变异。利用患者来源的鼻上皮细胞、气-液界面（ALI）培养体系及类器官模型，结合高速视频显微镜、透射/冷冻电镜、蛋白质组学和药理学干预等手段，系统证实了这些变异导致ODA锚定完全丧失和纤毛运动缺陷。意外发现ODAD1缺失还会减少MCCs数量、破坏其顶端组织，其机制与显著的肌动蛋白细胞骨架重塑有关。药理干预和基因回补实验分别部分挽救了细胞骨架/MCCs表型和纤毛运动功能。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
不想做实验，没数据，还想要快速发表文章，没问题的！公共数据库就是我们的数据宝藏！没思路不用担心，作为专业的生信团队，我们很乐意为你们效劳，提供研究路线设计和数据挖掘分析，扫码联系我们吧！
团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
题目：《ODAD1的功能缺失变异破坏ODA定位并引发原发性纤毛运动不良中的肌动蛋白细胞骨架重塑》Loss-of-function variants in ODAD1 disrupt ODA docking and induce actin cytoskeletal remodeling in primary ciliary dyskinesia
发表期刊：Cell Discovery
影响因子：12.5
研究背景：
- 疾病背景
PCD是一种遗传异质性疾病，由运动纤毛功能缺陷导致黏液纤毛清除功能障碍，表现为慢性呼吸道感染和左右不对称异常。
- 基因与蛋白功能
ODAD1编码外动力臂锚定复合物（ODA-DC）的结构组件，对于ODA在轴丝上的稳定附着至关重要。ODAD1变异是PCD的已知病因，但其对轴丝完整性和细胞功能的广泛影响尚不清楚。
- 研究缺口
ODAD1的突变谱，特别是在非欧洲人群中，仍未完全确定。此外，ODAD1功能障碍是否以及如何影响纤毛发生和上皮组织知之甚少。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 临床与遗传学定位
从PCD患者中通过遗传分析发现新的ODAD1纯合变异。
- 功能与结构验证
利用患者原代细胞和ALI培养模型，证实变异导致ODAD1蛋白缺失、纤毛运动频率（CBF）显著降低及ODA/ODA-DC结构完全缺失。
- 新表型发现与机制挖掘
通过扫描电镜（SEM）、结构光照明显微镜（SIM）和蛋白质组学分析，发现ODAD1缺陷导致MCCs减少和肌动蛋白骨架重塑。
- 机制干预与功能挽救
-
使用肌动蛋白聚合抑制剂（细胞松弛素B）处理，验证肌动蛋白失调在MCCs缺陷中的因果作用。
-
通过慢病毒在患者类器官中回补野生型ODAD1，验证其对纤毛结构和运动功能的挽救能力。
研究亮点：
- 发现新的致病变异
在中国汉族PCD患者中鉴定出一个新的纯合移码变异c.705_706insGCAG和一个复发的剪接位点变异c.-41-2A>C。
- 揭示非经典新表型
首次发现ODAD1缺陷不仅导致纤毛轴丝结构异常，还会引起肌动蛋白细胞骨架的广泛重塑，包括异常的F-肌动蛋白束化。
- 提出潜在治疗策略
证明药物抑制肌动蛋白聚合（如使用细胞松弛素B）可以部分挽救MCCs的丰度和多纤毛发生，提示肌动蛋白失调是一个可修饰的病理环节。
- 验证基因治疗可行性
通过慢病毒在患者来源类器官中重新表达野生型ODAD1，成功恢复了ODA组装和协调的纤毛搏动。
研究结果：
- 遗传学与临床特征
在9名患者中鉴定出4种不同的致病性ODAD1变异。所有患者均表现出典型PCD临床症状、低鼻一氧化氮水平和部分患者的内脏反位。
- 纤毛运动功能障碍
患者鼻上皮细胞和ALI培养物的纤毛搏动频率显著降低，运动模式不规则、不协调。
- 超微结构缺陷
透射电镜和冷冻电镜显示，变异导致ODA和ODA-DC完全缺失，并伴有中央对缺陷、微管错位等。不同变异对轴丝结构（如微管内蛋白组装）的影响存在差异。
- MCCs与细胞骨架表型
-
ODAD1缺陷的ALI培养物中MCCs丰度降低，剩余MCCs顶端表面积增大，基底体方向紊乱。
-
-
- 药理学挽救
用细胞松弛素B抑制肌动蛋白聚合，可减轻异常的肌动蛋白束化，并部分恢复MCCs的丰度和顶端表面积，但不能恢复纤毛搏动。
- 基因治疗挽救
在患者来源的顶向外交类器官中，慢病毒介导的野生型ODAD1重新表达，恢复了ODAD1蛋白的纤毛定位、ODA组装（DNAH9定位恢复）以及协调的纤毛搏动频率和模式。
研究总结：
- 结论
-
研究确认了新型及复发性ODAD1变异是导致PCD的功能缺失性等位基因。
-
ODAD1具有双重作用：既调控轴丝结构（ODA锚定），也维持上皮细胞骨架完整性。
-
ODAD1缺陷通过诱导肌动蛋白细胞骨架重塑，损害MCCs分化，这是PCD中一个新的、可靶向的病理机制。
-
靶向基因替换（慢病毒递送）可有效挽救主要的纤毛运动缺陷。
- 讨论与意义
-
研究扩展了ODAD1相关PCD的突变谱和表型谱，将发病机制从纤毛内部延伸到上皮组织层面。
-
肌动蛋白重塑的机制可能与平面细胞极性信号受损有关（初步数据显示VANGL1定位异常），但需进一步研究。
- 治疗启示
：针对原发性轴丝缺陷（如基因治疗）和继发性细胞骨架缺陷（如安全的细胞骨架调节剂）的联合策略，可能为PCD治疗提供新思路。但细胞松弛素B等药物因毒性和缺乏特异性，其临床应用价值有待评估。
结果译文：
遗传学分析在九例PCD患者中鉴定出四种不同的致病性ODAD1变异（参考转录本：NM_144577.4）（图1a）。来自三个无关联家庭的三例患者携带纯合移码变异c.705_706insGCAG，此为先前未在人群数据库中报道的新变异。四例患者为剪接位点变异c.41-2A>C的纯合子，该变异此前已在ClinVar中与PCD关联，但本研究首次提供详细表型特征。另外两例患者为复合杂合变异：一例携带c.41-2A>C和c.705_706insGCAG，另一例携带c.487-2A>C和c.41-2A>C。家系分析确认常染色体隐性遗传模式，各家庭双亲均为杂合携带者（图1b，c）。值得注意的是，ODAD1变异（c.705_706insGCAG和c.41-2A>C）在本患者队列中的复发可能提示潜在的奠基者效应而非反映普通人群频率。
临床上，所有九例患者均表现典型PCD特征，如慢性咳嗽、鼻窦炎、反复呼吸道感染及支气管扩张（表1和图1d-f），鼻一氧化氮水平（8.4-31.0 ppb）显著低于健康中国儿童参考值。c.705_706insGCAG纯合变异患者经历新生儿呼吸窘迫并发展为反复感染合并支气管扩张、肺不张及中耳炎。c.41-2A>C纯合变异患者同样经历反复感染，其中三例发展为支气管扩张。复合杂合变异患者亦表现慢性呼吸道感染并进展为支气管扩张，但无中耳炎。数例携带ODAD1变异的患者观察到内脏反位，符合左右体轴不对称随机化（图1e和表1）。值得注意的是，轻微呼吸系统外表现仅见于c.705_706insGCAG变异患者，包括胡桃夹综合征及脑室增大，而c.41-2A>C变异携带者未见此类异常。
RT-PCR表明两种ODAD1纯合变异均导致患者鼻腔上皮细胞中ODAD1表达水平降低（补充图S1a-c）。Sanger测序显示c.705_706insGCAG变异在核苷酸705与706之间插入四核苷酸GCAG（补充图S1d），而c.41-2A>C变异导致异常剪接，引起外显子2前19个核苷酸缺失（补充图S1e）。由于缺失发生在起始密码子上游，可能干扰翻译起始。
我们模拟了c.705_706insGCAG变异转录本编码蛋白的氨基酸序列以检查变异对蛋白质产物的影响。所得蛋白保留了247个氨基酸，包括两个保守的卷曲螺旋结构域，但与全长野生型蛋白相比被截短（补充图S1f，g）。在hRPE-1细胞中表达Flag标记的野生型和变异构建体以实验评估其表达，变异构建体产生截短蛋白（约30-35 kDa）（补充图S1h）。患者来源鼻腔上皮细胞的免疫染色显示内源性ODAD1蛋白缺失（补充图S1i），证实这些变异的功能丧失后果。部分患者细胞中观察到的微弱弥漫胞质信号与背景染色和/或不稳定截短蛋白产物相符，这些产物无法功能性整合至纤毛。综上，c.41-2A>C纯合样本中成熟ODAD1转录本及蛋白近乎完全缺失，强烈支持该剪接位点突变为功能丧失性ODAD1等位基因的分类。
鉴于ODAD1在纤毛运动中的关键作用，我们对受影响个体的新鲜分离鼻腔上皮细胞进行高速视频显微镜分析（图2a和补充视频S1-S9）。与健康对照中观察到的协调、节律性摆动相反，携带ODAD1变异患者的动纤毛呈现不规则、不协调运动（图2b）。描记分析证实典型正弦波模式丧失，提示严重机械功能障碍（图2c）。定量分析显示纤毛摆动频率显著降低（图2d），与黏液纤毛清除受损及慢性呼吸道症状一致。
我们从患者来源鼻腔上皮细胞建立气液界面培养以进一步评估这些变异的功能影响。这些培养重现了气道上皮的结构和功能（图2e）。Western blot和免疫染色分析显示c.705_706insGCAG或c.41-2A>C纯合变异培养中全长ODAD1蛋白完全缺失，且其在动纤毛中的定位相应丧失（图2f，g）。与在原代细胞中的观察一致，变异ALI培养的HSVM显示纤毛运动严重受损，呈现紊乱、低幅度摆动（图2h和补充视频S10-S14）。CBF定量分析证实变异ALI培养中纤毛活性显著降低（图2i），强化了ODAD1在维持有效纤毛运动中的关键作用。我们观察到新鲜分离鼻腔刷检与ALI培养之间的纤毛摆动模式存在差异。鼻腔刷检含有异质性细胞混合物及黏液，其中部分分化不完全或受机械刺激的纤毛可表现出有限残余运动。相反，ALI培养生成均一、完全分化的上皮，揭示了ODAD1功能障碍导致的固有不运动性。
我们通过透射电镜在分化第24天的ALI培养动纤毛中探究ODAD1变异（c.705_706insGCAG和c.41-2A>C）是否导致超微结构异常。TEM分析显示经典PCD相关缺陷，包括外动力臂完全缺失、中央对异常及外周微管缺陷（图3a，b）。CP标志物SPEF2的免疫荧光染色进一步显示ODAD1缺陷ALI培养中SPEF2阳性纤毛簇显著减少（补充图S3a，b），证实存在先前未报道的CP缺陷。
我们从健康对照及两例ODAD1变异纯合患者的ALI培养中分离动纤毛，以近原子分辨率进一步评估这些结构缺陷。经去垢剂处理去除纤毛膜后，使用冷冻电镜分析轴丝（图3c，d）。对8 nm颗粒的初始三维精修得到对照及变异纤毛DMT的清晰密度图（补充图S2a，b）。进行三维分类以生成48 nm和96 nm周期性DMT颗粒并解析MIPs和轴丝复合体（补充图S2c-e和表S1）。两种变异均表现ODA和ODA-DC完全缺失，提示ODAD1对ODA对接不可或缺（图3e）。c.41-2A>C变异纤毛中MIPs、IDA、RS和N-DRC与对照相比保持结构完整性（图3e，f）。值得注意的是，在c.705_706insGCAG变异纤毛中，使用NME7球状结构域作为分类标志物生成的48 nm密度图显示A管和B管内存在额外密度，且NME7标志附近密度紊乱，提示MIP组装不完美。此外，尽管检测到轴丝复合体，3D分类未能重建96 nm密度图，表明c.705_706insGCAG变异纤毛中IDA、RS和N-DRC可能存在错误定位（图3e）。
综上，TEM和cryo-EM分析证明不同ODAD1变异导致ODA和ODA-DC完全丧失，以及不同程度的CP丢失、DMT错误定位及MIPs和轴丝复合体对接受损，突显ODAD1在维持纤毛结构和运动中的关键作用。有趣的是，结构分析显示不同ODAD1变异对轴丝结构产生不同影响。
4.ODAD1变异减少多纤毛细胞丰度并破坏其顶面组织
ODAD1变异ALI培养在分化第24天的扫描电镜显示纤毛密度显著降低，伴纤毛定向紊乱（图4a-c）。我们评估基底体的分布和密度以探究这些缺陷的结构基础，基底体对正常纤毛形成和对齐至关重要。结构光照明显微镜显示ODAD1变异培养中单位面积基底体密度显著降低（图4d，e），且顶面分布不规则，缺乏健康上皮中观察到的均一间距和定向。
我们量化每个MCC的基底体数量以确定基底体密度下降是否源于基底体生成受损或MCC丰度降低。该数量在对照与ODAD1变异培养之间相当（图4f），表明单个MCC内基底体生成未受影响。相反，基底体密度的整体降低源于ODAD1变异上皮中MCC比例减少，免疫荧光染色和共聚焦成像证实了这一点（图4g，h）。此外，单个MCC显示顶面表面积显著增大（图4i），提示上皮堆积和极性改变而非基底体扩增延迟。
我们将ALI培养延长至第36天以排除观察到的缺陷由分化延迟所致的可能性。ODAD1变异ALI培养持续显示MCC数量减少（补充图S4a，b）、MCC顶面面积增大（补充图S4a，c）及基底体分布异常（补充图S4d-f），与这些表型的持续性一致。
综上，这些结果表明ODAD1变异主要通过减少MCC丰度并破坏其顶面组织而损害上皮结构，而每个MCC的基底体生成保持完整。
5.ODAD1变异导致MCC中肌动蛋白细胞骨架重塑
我们通过对携带c.705_706insGCAG或c.41-2A>C纯合变异患者来源ALI培养进行定量蛋白质组学分析，探究ODAD1变异培养中MCC缺陷的分子机制。差异表达分析（|log₂(倍数变化)| > 0.5；校正P < 0.05）鉴定出两种ODAD1变异培养中一致上调的80种蛋白和下调的168种蛋白（补充图S5a和表S2-S3）。GO富集分析揭示下调蛋白显著关联纤毛组分和功能，包括轴丝、基底体、动纤毛组装及纤毛运动调控（补充图S5b），而上调蛋白富集于肌动蛋白细胞骨架相关过程，如纤维束组装、肌动蛋白组织和动力学（图5a-c和补充表S4和S5）。
受这些发现启发，我们使用F-actin染色检查肌动蛋白结构。ODAD1变异培养在所有上皮层中均表现显著的细胞骨架重塑（图5c）。在顶面，与对照培养MCC相比，ODAD1变异培养MCC显示显著更厚、更致密的F-actin束。在中间层，ODAD1变异培养的肌动蛋白丝沿细胞边界高度压实；此外，在基底层，正常的丝状肌动蛋白网络被斑块状点状聚集体取代。图像定量分析确认ODAD1变异MCC中肌动蛋白束厚度增加及细胞连接处F-actin强度升高（图5d-f），提示异常肌动蛋白成束和聚合。
我们从健康供体气道上皮细胞生成CRISPR/Cas9介导的ODAD1敲除ALI培养以排除患者特异性遗传背景的影响。Western blotting和免疫荧光染色确认敲除高效，ODAD1表达缺失且纤毛定位消失（补充图S6a，b）。这些ODAD1敲除培养忠实地再现了患者来源模型中观察到的关键表型，包括纤毛密度降低、MCC数量减少及异常肌动蛋白重塑（补充图S6c-j）。
综上，这些发现表明ODAD1在支持纤毛运动及维持气道上皮正常肌动蛋白细胞骨架组织中发挥双重作用。
6.药物调节肌动蛋白部分恢复ODAD1变异培养中MCC形成和纤毛发生
鉴于ODAD1变异培养中观察到的显著肌动蛋白细胞骨架重塑，且考虑到肌动蛋白网络的正常组织对多纤毛细胞成熟至关重要——支持基底体对接、顶面扩展及纤毛对齐——我们测试了药物调节肌动蛋白动力学是否能挽救MCC相关缺陷。我们在分化第12天开始向ODAD1变异患者来源ALI培养的基底外侧培养基中加入肌动蛋白解聚剂细胞松弛素B处理48小时，分析于第24天进行。
免疫荧光染色显示Cyto B处理有效减少ODAD1变异培养中异常F-actin成束（图6a，b）。值得注意的是，该效应伴随MCC数量显著增加及正常MCC顶面面积的恢复（图6c-e），以及纤毛密度和组织的改善（图6f-h）。
这些发现提示肌动蛋白失调是ODAD1缺陷的关键下游后果，并导致MCC分化和纤毛发生受损，而每个MCC的基底体数量保持不变（图6i）。然而，尽管Cyto B处理增加MCC形成并改善顶面组织，它并未恢复纤毛运动。这一结果符合预期，因为ODAD1变异细胞缺乏功能性ODA对接复合体，因而无法组装外动力臂；该原发轴丝运动缺陷无法通过调节肌动蛋白细胞骨架来纠正（补充视频S15-S18）。
7.慢病毒介导的基因递送挽救ODAD1变异类器官中的纤毛运动
我们通过慢病毒转导将野生型ODAD1引入ODAD1变异患者来源的顶外翻类器官，以直接解决ODAD1变异引起的功能丧失表型（图7a）。Western blot分析确认转导类器官中ODAD1蛋白稳健表达，而未处理对照中未检测到表达（图7b，c）。免疫染色进一步显示外源蛋白正确定位于动纤毛，表明功能性ODAD1成功整合（图7d，e）。
使用HSVM的功能分析显示慢病毒ODAD1再表达恢复了协调的纤毛运动，CBF增加至接近生理水平（图7f，g和补充视频S19-S22）。恢复的纤毛表现出与健康对照相当的正弦波样摆动模式（图7h，i），确认c.705_706insGCAG和c.41-2A>C变异均为功能丧失等位基因。此外，慢病毒ODAD1表达在顶外翻类器官中恢复了ODA对接，表现为DNAH9的轴丝定位恢复（图7j），证实超微结构恢复。这些结果表明靶向基因替代可有效挽救运动缺陷，为ODAD1相关PCD患者的治疗干预提供了潜在途径。
此外，我们还在顶外翻类器官模型中检测了MCC相关表型，以精确确认ODAD1缺陷对MCC分化的影响。结果显示与对照类器官相比，ODAD1缺陷类器官中MCC丰度显著降低（补充图S7a，b），每个MCC面积增加（补充图S7a，c），且肌动蛋白组织异常（补充图S7d，e）。重要的是，慢病毒表达部分纠正了异常肌动蛋白组织并恢复了MCC相关表型（补充图S7f-j）。
更多结果和补充图表：doi： 10.1038/s41421-026-00875-8
长按二维码关注我们，用最短的时间和最高的效率学习更多数据分析方法!
扫描上方二维码或登录平台官网后添加CNSknowall客服微信咨询！官网地址：
https://cnsknowall.com
CNSknowall：24年最新问世的遥遥领先的科研数据（0代码生信+统计学）分析平台，同时含有机制图模块+汉化版Pubmed融合Deepseek高效筛选目标文献+SCI文献例句/语料检索模块+OPenAI官方GPT接口，＞500款CNS级别图表皆可一秒内一键出图，登录即秒变数据分析大神，体验前所未有的便捷数据分析之旅，开启科研天骄之路！
可向下滑动批阅！
