2区7.3分！ATG5过表达增强间充质干细胞抗炎抗氧化能力！转录组学+代谢组学+16S rRNA多组学生信分析揭示IL-17/NF-κB抑制、产丁酸菌富集！

间充质干细胞（MSC）在治疗炎症性肠病（IBD）中显示出潜力，但其疗效受限于氧化应激微环境。自噬相关基因5（ATG5）是自噬过程的关键基因。本研究通过缺氧+血清剥夺（H/SD）预处理发现，ATG5在MSC中显著上调。进一步利用腺病毒过表达ATG5（MSCs-ATG5），发现其增强MSC的自噬活性和抗氧化能力（上调HMOX-1、SOD2、CAT，增加GSH-Px和CAT酶活性），同时促进M2巨噬细胞极化。转录组学（RNA-seq）显示MSCs-ATG5抑制IL-17/NF-κB炎症通路；非靶向代谢组学发现其上调抗炎代谢物前列腺素D2（PGD2）；16S rRNA菌群分析显示产丁酸菌（Oscillospirales）丰度增加。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，MSCs-ATG5显著改善疾病活动指数、恢复结肠长度、修复肠屏障。本研究为ATG5工程化MSC治疗IBD提供了多组学证据。

今天给大家解读一篇4月发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的题目为“ATG5 overexpression enhances the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells in a mouse colitis model by augmenting anti-inflammatory and antioxidative mechanisms.”的文章。该研究旨在考察ATG5在MSCs抗氧化能力中的作用，并评估ATG5工程化MSCs对结肠炎的治疗效果。通过体外实验（缺氧/血清剥夺预处理、腺病毒介导ATG5过表达）验证ATG5对自噬、抗氧化和增殖的影响，然后在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中评估疗效，并结合RNA转录组测序、非靶向代谢组学和16S rRNA微生物组分析探索机制。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！

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团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
       
       
       

        
       
       
       

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CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

1. 体外预实验
   用缺氧（1% O₂）和血清剥夺处理MSCs，观察自噬和ATG5表达变化。
2. 构建ATG5过表达MSCs（MSCs-ATG5）
   通过腺病毒载体实现ATG5过表达，检测自噬活性、抗氧化基因/酶活性、细胞增殖及表面标志物变化。
3. 免疫调节功能检测
   评估MSCs-ATG5对巨噬细胞极化（M2型）的影响及氧化应激相关信号通路。
4. 体内疗效验证
   在DSS诱导的结肠炎小鼠中注射MSCs-ATG5，观察疾病症状改善。
5. 机制探索
   利用转录组分析鉴定被抑制的炎症通路（IL-17/NF-κB），通过代谢组检测结肠组织PGD2水平，通过16S rRNA分析肠道菌群变化。

研究亮点：

• 发现缺氧和血清剥夺预处理可显著增强MSCs的自噬并上调ATG5表达。
• 证实ATG5过表达直接增强MSCs的抗氧化酶活性（谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶）和关键抗氧化基因（HMOX-1、SOD2、CAT）的表达。
• 通过多组学（转录组、代谢组、16S微生物组）揭示ATG5工程化MSCs在结肠炎小鼠中同时调控炎症信号、代谢产物和肠道菌群。

研究结果：

• 缺氧及血清剥夺预处理显著增强MSCs自噬并上调ATG5表达。
• MSCs-ATG5增强自噬活性和抗氧化能力（上调HMOX-1、SOD2、CAT；增加谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性），促进细胞增殖，不改变表面标志物。
• MSCs-ATG5显著促进M2巨噬细胞极化，调节氧化应激相关信号通路。
• 在小鼠结肠炎模型中，MSCs-ATG5治疗明显改善疾病症状。
• 转录组分析显示MSCs-ATG5抑制IL-17/NF-κB炎症信号通路。
• 代谢组分析表明治疗提高了结肠组织中抗炎代谢物PGD2的水平。
• 微生物组分析发现MSCs-ATG5增加产丁酸菌（如Oscillospirales）的丰度，缓解肠道菌群失调。

研究总结：

结果译文：

UC-MSC在缺氧（1%氧气）和血清剥夺条件下培养。图1A显示了H/SD条件下24小时自噬体的形成。随后，我们在MSC于H/SD条件下孵育12、24和36小时后，通过qRT-PCR检测了经典自噬相关基因（包括ATG3、ATG5、ATG7、ATG12和Beclin-1）的表达水平。与常氧条件相比，H/SD条件显著增强了ATG5、ATG7和Beclin-1的表达（图1B）。此外，基于蛋白质印迹分析，H/SD条件下12小时和24小时HIF-1α、ATG16L1、ATG5和LC3 II/I的蛋白表达均上调。P62表达在12小时上调，随后在24小时下调，表明H/SD条件下自噬流畅通无阻（图1C-D）。

携带ATG5的腺病毒载体示意图见图S1A。将Ad-GFP和Ad-ATG5腺病毒颗粒分别以MOI 100和200转染UC-MSC。转染效率在MOI 100时达到78.7%，在MOI 200时达到92.8%（图S1B、C）。MSC转染Ad-GFP或Ad-ATG5后通过荧光显微镜观察到GFP荧光（图2B）。qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实，MSCs-ATG5中ATG5在mRNA和蛋白水平均过表达（图2C、D）。通过流式细胞术检测了MSC-GFP和MSC-ATG5表面标志物（如CD90、CD105、CD73、CD11b、CD34和CD45）的表达。腺病毒介导的ATG5转染未改变细胞形态或MSC表面标志物的表达（图2A、G）。然而，在常氧和H/SD条件下，转染后24和48小时，MSCs-ATG5的细胞活力均显著高于MSCs-GFP（图2D、E）。类似地，Dye670染色分析表明，与MSCs-GFP相比，MSCs-ATG5表现出显著更高的增殖指数（图2F）。

在本部分中，T细胞和巨噬细胞被用作效应细胞来验证MSC的免疫调节能力。荧光素酶-T实验表明，与MSCs-GFP相比，MSCs-ATG5在抑制T细胞增殖方面具有显著增强的功效（图3A）。RAW264.7细胞通常用作巨噬细胞极化的模型。因此，将MSCs-GFP和MSCs-ATG5分别与RAW264.7细胞共培养24小时。通过流式细胞术检测吞噬能力。共培养24小时后，MSCs-GFP和MSCs-ATG5均显著增强了RAW264.7细胞的吞噬能力，但在MSCs-ATG5和MSCs-GFP之间未观察到吞噬增强效应的显著差异（图3B）。MSCs-ATG5对RAW264.7细胞增殖的增强作用强于MSCs-GFP（图3C）。使用流式细胞术检测M1巨噬细胞标志物CD86和M2巨噬细胞标志物CD206。将RAW264.7细胞与MSC共培养后，RAW264.7细胞的M2极化能力显著增强，且MSCs-ATG5对RAW264.7细胞M2极化（CD206+）的增强作用更强（图3D）。与MSC共培养后，通过qRT-PCR检测M1/M2巨噬细胞标志物。MSCs-ATG5抑制了部分M1标志物（如Tnfa和Nos2）的表达，并促进了M2标志物（如Ym1、CD206和Arg1）的表达（图3E、F）。此外，使用LPS诱导巨噬细胞炎症。LPS显著增加了M1巨噬细胞（CD86+）的比例（图3G）。将LPS诱导的RAW264.7细胞与MSC共培养后，MSCs-ATG5具有更强的抑制M1巨噬细胞的能力，并能促进巨噬细胞向M2巨噬细胞转化（图3G）。qRT-PCR结果显示，LPS显著促进了M1巨噬细胞标志物（如Tnfa和Nos2）的表达，并抑制了M2巨噬细胞标志物（如Ym1、CD206和Arg1）的表达（图3H、I）。qRT-PCR结果与MSCs-ATG5共培养后的流式细胞术结果一致。两种MSC（MSCs-GFP和MSCs-ATG5）均抑制了M1巨噬细胞标志物（Tnfa和Nos2）的表达，同时上调了M2巨噬细胞标志物（Ym1和Arg-1）的表达。与MSCs-GFP组相比，MSCs-ATG5组在M1标志物表达方面无显著差异，但显著增强了M2标志物的表达。LPS显著增强了RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-6。与MSCs-GFP相比，MSCs-ATG5对这些细胞因子分泌的抑制能力增强（图3J、K）。

为了进一步阐明ATG5调节MSC生物学特性的机制，对MSCs-GFP和MSCs-ATG5进行了RNA测序，每组三个生物学重复。基于两组之间鉴定的DEGs，进行了KEGG富集分析以探索MSCs-GFP和MSCs-ATG5之间的信号通路和功能差异。根据与DEGs相关的显著改变的代谢和信号转导通路（MSCs-ATG5 vs MSCs-GFP），p53信号通路、细胞衰老和铁死亡主要富集（图4B）。值得注意的是，这些信号通路与氧化应激相关。通过筛选DEGs并将其映射到这些特定信号通路，关键DEGs可总结如下。在p53信号通路中，MSC中ATG5过表达显著增加了FAS、SESN2、SESN3、CDKN1A、IGFBP3和MDM2的表达。在细胞衰老信号通路中，MSC中ATG5过表达显著增加了PIK3R3、CDKN1A、IGFBP3和MDM2的表达。在铁死亡信号通路中，MSC中ATG5过表达显著增加了SLC7A11的表达。

为了评估MSCs-ATG5的体内治疗效果，我们使用了DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠模型。实验流程如图5A所示。DSS诱导后，小鼠体重在第5天开始下降，而MSCs-ATG5治疗在DSS+PBS组和DSS+MSCs-GFP组体重持续下降的情况下，显著恢复了体重（图5B）。与NC组相比，DSS+PBS组结肠长度显著缩短；MSCs-ATG5治疗有效恢复了结肠长度，而MSCs-GFP治疗未产生显著效果（图5C、D）。疾病活动指数（DAI）分析显示，与DSS+PBS组相比，MSCs-ATG5治疗显著降低了DAI评分（图5E）。结肠组织的H&E染色显示，与DSS+PBS组相比，MSCs-ATG5治疗显著减轻了炎症细胞浸润、隐窝损伤和黏膜下层水肿（图5F）。Luminex检测显示，与DSS+PBS组相比，MSCs-ATG5治疗降低了促炎细胞因子（包括IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、G-CSF和IL-17A）的血清水平，同时增加了抗炎因子如IL-10和IL-4的分泌（图5G）。此外，MSC-ATG5治疗上调了肠上皮紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达（图5H、J、K）。值得注意的是，免疫荧光显示MSCs-ATG5治疗组结肠组织中CD206+巨噬细胞上调（图5I）。

对上述小鼠模型的结肠组织进行了RNA-seq分析。随后的KEGG富集分析显示，与正常组相比，DSS模型组中上调的基因主要富集在经典的炎症相关信号通路中。这些通路包括IL-17信号通路、TNF信号通路以及与IBD相关的通路（图S2D）。随后，我们分析了MSC-ATG5组和DSS模型组之间的DEGs。图6A、B显示了ATG5组与DSS组相比DEGs的火山图和热图。有趣的是，KEGG富集分析显示，MSC-ATG5组中下调的基因在IL-17和NF-κB信号通路中显著富集（图6C）。其中，被MSCs-ATG5抑制的IL-17信号通路中的基因包括Csf2、Mapk4、Cxcl3、Cxcl1、Mmp13和Lcn2（图6D），NF-κB信号通路中下调的基因包括Card14、Cxcl3和Cxcl1（图6E）。在DSS诱导的小鼠结肠炎中，NF-κB信号通路被显著激活，表现为p65蛋白磷酸化增加、IkBα蛋白降解以及IL-17信号通路蛋白上调。MSC-ATG5治疗有效降低了p65磷酸化，增强了IkBα蛋白稳定性，并抑制了IL-17信号通路（图6F-I）。接下来，我们在体外进行了IEC-6和MSC的共培养实验。使用H/SD条件模拟体内的氧化应激环境。通过qRT-PCR检测上述IL-17和NF-κB信号通路基因。结果表明，MSCs-ATG5能够抑制Card14、Mmp13和Cxcl3等基因的表达（图6J-N）。对DEGs的GO富集分析显示，MSCs-ATG5调节结肠细胞中的多个生物学过程，如免疫反应、免疫系统过程、B细胞介导的免疫和炎症反应（图S2E）。

溃疡性结肠炎中的炎症相关代谢物是调节其病理进展的关键因素。我们对MSC-ATG5组和DSS模型组小鼠的结肠组织进行了非靶向代谢组学测序。火山图显示了通过正/负离子模式筛选鉴定的差异代谢物（MSCs-ATG5 vs. DSS，OPLS-DA VIP > 1，P < 0.05）。基于正/负离子模式的具体差异代谢物以蝴蝶图说明。蝴蝶图显示了ATG5组中上调和下调的代谢物，以及差异比率的分析。我们选择负离子模式下的PGD2用于后续实验（图7A）。环氧合酶-2（COX-2）和PGD2通过体内的前列腺素合成途径具有密切的上下游关系。因此，我们使用免疫荧光染色检测了结肠组织中PGD2合酶（PTGDS）的表达（图7B、C），结果表明MSC-ATG5治疗显著增加了PTGDS水平。随后，我们检测了结肠组织中COX-2的表达，结果显示与其他组相比，MSC-ATG5组COX-2表达呈上调趋势（图7D、E）。为了进一步研究MSCs-ATG5如何调节前列腺素PGD2，我们量化了小鼠血清中该蛋白的水平，结果显示MSCs-ATG5组中PGD2水平升高（图7F）。此外，我们在常氧和H/SD条件下测量了MSC和MSCs-ATG5分泌PGD2的情况。MSC在基础条件下分泌低水平的PGD2，而ATG5过表达显著增加了PGD2分泌（图S3D）。值得注意的是，随着H/SD条件暴露时间的延长，PGD2分泌能力下降（图S3E）。在H/SD条件下孵育后，MSCs-ATG5的培养上清液（图S3F）和细胞内（图S3G）中的PGD2水平均显著高于MSCs-GFP。PGD2主要由肥大细胞和巨噬细胞分泌。因此，我们将肥大细胞系P815和巨噬细胞系RAW264.7与MSCs-GFP或MSCs-ATG5共培养。MSCs-ATG5显著促进了P815和RAW264.7细胞分泌PGD2（图7G、H）。更重要的是，PGD2促进了IEC-6细胞的增殖（图7I）。在H/SD条件下，PGD2对IEC-6细胞中的NF-κB和IL-17信号通路具有抑制作用，而这种抑制作用被PGD2拮抗剂（PGD2-IN-1）逆转（图7J-N）。

MSC-ATG5治疗后，DSS诱导的肠道菌群组成发生显著改变（图8A）。使用LEfSe方法鉴定MSC-ATG5组和DSS组之间存在显著差异的微生物生物标志物。通过LEfSe数据的可视化，该图显示了MSC-ATG5组和DSS组之间显著差异物种的LDA评分。MSC-ATG5治疗后，肠道菌群中益生菌类群如普雷沃氏菌科、Allobaculum和Oscillospirales的相对丰度显著高于DSS-PBS治疗后（图8B）。Oscillospirales包含产丁酸细菌。使用STAMP差异分析方法比较MSC-ATG5组和DSS组之间的物种丰度。类似地，MSC-ATG5组中Oscillospirales的平均比例更高（图8C）。通过对肠道菌群的KEGG功能分析，MSC-ATG5治疗显著增强了肠道菌群对环境变化的代谢功能适应性，包括复制和修复、细胞生长和耐药性（图S4C）。流式细胞术结果显示，与DSS组相比，MSC-ATG5组中CD206+巨噬细胞的比例更高。丁酸钠（0.1、0.5和1 mM）以浓度依赖性方式增加了CD206+巨噬细胞的比例，并降低了CD86+巨噬细胞的比例（图8D-F）。qRT-PCR分析显示，丁酸钠抑制了M1标志物（Tnfa、Nos2）的表达，并促进了M2标志物（Ym1、CD206）的表达（图8G）。此外，丁酸钠还抑制了LPS刺激的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6（图8I、J）。这些结果表明，丁酸促进巨噬细胞向M2表型极化，并抑制炎症反应。

更多结果和补充图表：doi：10.1186/s13287-026-05008-2

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