今天给大家解读一篇4月发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的题目为“Induction of fibrosis in human kidney organoids delineates mechanisms and therapeutic targets of fibrotic kidney disease.”的文章。本研究旨在解决肾纤维化研究中缺乏高保真、可高通量操作的临床前模型的问题。研究者利用人iPSC分化为肾类器官，并通过施加TGF-β1细胞因子，成功诱导出具有肾纤维化典型病理特征的体外模型。通过组织学、转录组测序以及药物干预，他们不仅验证了模型的可靠性，还揭示了JAK/STAT信号通路是TGF-β介导纤维化的关键下游通路。在此过程中，他们鉴定出PIM1激酶是一个新的潜在纤维化介导因子和治疗靶点，其抑制剂AZD1208能有效减轻类器官的纤维化程度。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《在人肾类器官中诱导纤维化描绘了纤维化肾病的机制和治疗靶点》Induction of fibrosis in human kidney organoids delineates mechanisms and therapeutic targets of fibrotic kidney disease
发表期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：7.3
研究背景：
- 疾病问题
慢性肾病（CKD）是全球主要公共卫生问题，表现为肾纤维化，即细胞外基质过度沉积导致组织结构和功能破坏。TGF-β1是肾纤维化的核心驱动因子。 - 现有模型局限
传统2D单层细胞培养缺乏组织结构、细胞异质性和细胞间对话；动物模型（如UUO模型）成本高、耗时长，且与人体并非完全一致。 - 类器官兴起
从多能干细胞衍生的3D类器官可在体外模拟器官发育、生理和疾病，为研究提供新工具，但此前对肾类器官纤维化表型的详细表征和应用潜力挖掘不足。 - 研究目的
建立并详细表征一个TGF-β1诱导的人肾类器官纤维化模型，并利用该模型探索肾纤维化的新机制和治疗靶点。
研究思路：
- 模型构建
依据已发表方案，将人iPSC分化为成熟的肾类器官，验证其包含足细胞、近端/远端肾小管及间质细胞。 - 疾病诱导
在分化第21天至26天，对成熟肾类器官施用TGF-β1重组细胞因子，诱导纤维化表型。 - 表型验证
通过免疫荧光、定量PCR和电子显微镜等技术，观察和量化类器官的病理特征（如成肌纤维细胞扩增、肾小球硬化、肾小管萎缩、胶原沉积等）。 - 机制探索
对纤维化类器官和对照类器官进行全转录组RNA测序，鉴定差异表达基因和富集的信号通路。 - 靶点验证
基于测序结果，重点关注JAK/STAT通路。使用JAK抑制剂Tofacitinib验证通路功能。进一步挖掘通路富集基因，发现PIM1，并在类器官模型中利用其选择性抑制剂AZD1208验证其作为治疗靶点的潜力。 - 临床相关性验证
利用公开的临床数据库（Nephroseq），验证PIM1在CKD患者肾活检组织中的高表达。
研究亮点：
- 模型建立与验证
成功在肾类器官中稳定诱导出纤维化表型，并通过组织学、免疫荧光和全转录组分析，系统验证了该模型与人类纤维化肾病的高度相似性，为后续机制研究提供了可靠平台。 - 关键通路发现
通过无偏倚的RNA测序筛选，明确指出了JAK/STAT信号通路是TGF-β介导的肾纤维化的关键驱动因素，并通过抑制剂验证了其因果作用。 - 新靶点鉴定
在JAK/STAT通路的下游靶点中，鉴定出PIM1激酶在受损近端肾小管细胞中特异性上调，并在患者数据库中得到验证，为肾纤维化提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。
研究结果：
- 成功构建纤维化模型
TGF-β1处理后的肾类器官出现成肌纤维细胞（α-SMA+）扩增，足细胞、近端和远端肾小管减少，表现出肾小球硬化、小管萎缩和间质纤维化等典型病理特征，且通过ALK5抑制剂SB-431542验证了该过程是由TGF-β信号介导的。 - 转录组特征
RNA测序显示纤维化类器官与对照类器官在转录组水平显著分离。差异表达基因富集于上皮间充质转化、炎症、代谢和JAK/STAT信号等与肾纤维化密切相关的通路。 - JAK/STAT的驱动作用
JAK/STAT信号通路在纤维化类器官中高度富集，JAK抑制剂Tofacitinib可显著减少α-SMA+成肌纤维细胞，表明该通路是TGF-β介导纤维化的关键下游机制。 - PIM1的鉴定与验证
在JAK/STAT通路富集基因中，PIM1此前未被报道参与肾纤维化。免疫荧光显示PIM1特异性定位于纤维化类器官中受损的近端肾小管细胞。患者数据库分析证实，PIM1在CKD患者肾活检组织中高表达（位列前3%）。 - PIM1靶点验证
使用PIM1抑制剂AZD1208处理，能显著减少纤维化类器官中的α-SMA+肌成纤维细胞，并下调纤维化标志基因ACTA2和COL1A1的表达，表明抑制PIM1可减轻纤维化。
研究总结：
结果译文：
1.从人诱导多能干细胞生成肾脏类器官
我们基于先前发表的方案[18,25]，使用iPSC(IMR-90)-4人iPSC系生成了人肾脏类器官（图1A）。为了验证iPSC分化过程中肾脏发育阶段的忠实再现，我们在不同时间点进行了qRT-PCR和免疫荧光分析（图S1A和S1B）。在用8 μM CHIR99021处理4天以诱导WNT活性，并联合5 ng/ml noggin抑制BMP信号后，iPSC下调了多能性标志物OCT4和NANOG，并上调了原条标志物TBXT（T）和MIXL1（图S1A和S1B）。从第4天到第7天，在activin存在下，细胞进展至后中间中胚层阶段，表达相应标志物OSR1和WT1；从第7天到第9天，在FGF9的作用下，细胞进一步向以后中间中胚层为特征的细胞发育，表达PAX2和SIX2（图S1A和S1B）。与先前的报道一致[16,18]，我们发现不同的细胞系需要特定水平的BMP信号才能成功分化为SIX2⁺后中间中胚层肾单位祖细胞。在我们的实验中，与无BMP抑制的分化相比，当在前4天分化期间用5 ng/ml noggin抑制BMP信号时，iPSC(IMR-90)-4 iPSCs在第9天高效分化为SIX2⁺肾单位祖细胞（图S2）。第9天的肾单位祖细胞被转移到3D培养中并暴露于FGF9直至第14天。从第9天到第11天，用CHIR99021处理细胞以诱导分化为肾单位上皮细胞。成熟的类器官显示出典型的形态学特征（图1B），并包含具有PODXL足细胞、LTL近端小管和CDH1远端小管的分化肾单位（图1C）。类器官内的足细胞自组织成肾小球样结构，并高表达成熟足细胞标志物nephrin（NPHS1）、podocin（NPHS2）和podocalyxin（PODXL）（图1D、1E和1F）。此外，类器官足细胞显示出富含NPHS1和NPHS2的细胞-细胞连接，类似于足细胞裂孔隔膜（图1E）。透射电子显微镜揭示了足细胞的特征性超微结构特征，包括大的不规则细胞核以及初级和次级足突（图S3A）。小管结构显示出分节段为LTL近端小管和CDH1远端小管，两个节段均形成管腔（图1G）。LTL远端小管通过存在富含COL1A1的基底膜与LTL近端小管进一步区分（图1H）。使用类器官总RNA进行的qRT-PCR显示成熟小管细胞标志物的表达，如LRP2、SLC12A1或UMOD（图1I）。小管细胞的TEM显示初级纤毛和紧密连接（图S3B）。我们还对肾脏类器官的基质区室进行了表征。免疫荧光分析显示，类器官基质包含少量CD31⁺毛细血管样结构（图1J），主要由α-SMA⁻ PDGFRα⁺间质成纤维细胞组成，并散布着含COL1A1的ECM，与人类肾脏基质非常相似（图1K和1L，S3C）。总体而言，这些结果表明，使用标准方案将iPSC(IMR-90)-4分化为肾脏类器官可产生复杂的多谱系肾脏结构，适用于疾病建模。
2.肾脏类器官作为肾纤维化的体外疾病模型
我们探索了一种获得广泛适用且对不同病因肾纤维化具有广泛有效性的肾纤维化类器官模型的方法。TGF-β1已被确定为肾纤维化和CKD最重要的关键驱动因素之一[5]。我们通过在分化方案的第21天至第26天给予重组TGF-β1细胞因子，能够在类器官中诱导纤维化表型（图2A）。这些纤维化肾脏类器官显示出α-SMA⁺肌成纤维细胞的扩张（肾纤维化中主要的致病细胞类型[4]），而完整的肾单位结构则减少（图2B）。测试不同的TGF-β1处理持续时间（1至5天）表明，4天或5天的处理足以诱导类器官发生不可逆的重塑，如第33天免疫荧光分析所示（图S4）。免疫荧光分析进一步揭示了纤维化肾病的其他组织病理学标志，包括肾小球硬化和伴有肾小管周围纤维化的小管萎缩（图2C）。对肾单位上皮细胞类型的定量显示纤维化类器官的细胞组成发生改变，肾小球（足细胞）、近端和远端小管减少（图2D）。相比之下，α-SMA⁺肌成纤维细胞的百分比增加了两倍以上（图2E）。同样，qRT-PCR分析显示，肾单位上皮的标志基因，如足细胞标志物PODXL、NPHS1、NPHS2和WT1，近端小管标志物LRP2，以及远端小管标志物CDH1和SLC12A1均显著下调（图2F），而促纤维化基因ACTA2、COL1A1和纤连蛋白1（FN1）则上调（图2G）。类器官纤维化还伴随着COL1A1⁺ ECM沉积增加和PDGFRα⁺间质成纤维细胞的增殖（图2H）。胶原沉积的增加也通过天狼星红染色得到证实（图S5）。我们测试了与小分子SB-431542（一种转化生长因子-β I型受体（ALK5）的选择性抑制剂）的联合处理，并观察到纤维化表型得到改善。这证实了纤维化诱导是由TGF-β1结合ALK5介导的，同时也证明了该疾病模型用于药物测试的可行性（图S6）。因此，我们测试了一些已知作为纤维化肾病潜在治疗的药物化合物，其确切作用机制在很大程度上仍然未知，例如达格列净，其直接的抗纤维化作用在该模型中得到了证实（图S7）。
3.模拟肾纤维化的肾脏类器官的全转录组分析
为了研究全基因组转录变化，我们对完整纤维化和对照类器官进行了二代RNA测序。PCA分析显示来自3个独立实验的样本紧密聚类，且两组之间明显分离（图3A），表明纤维化相关全基因组转录调控的一致性。总体而言，与正常对照类器官相比，我们在纤维化肾脏类器官中发现1968个基因显著上调，而1628个基因显著下调（图3B和S8）。引人注目的是，基因集富集分析揭示了已知在肾纤维化和CKD中起关键作用的信号通路的差异调节：上皮-间质转化、炎症信号，以及与细胞周期控制和代谢相关的通路（图3C和3D）。在高度富集的炎症信号通路中，我们鉴定了JAK/STAT信号通路，该通路先前已被讨论为肾纤维化的核心介质和潜在治疗靶点[27]。总之，全转录组分析表明纤维化肾脏类器官与纤维化肾病之间存在一致性，并提示该模型可作为筛选参与肾纤维化的新型分子机制的筛选平台。
4.在人肾脏类器官中诱导纤维化揭示了JAK/STAT信号在TGF-β介导的纤维发生中的主要作用
对患者样本或肾纤维化动物模型的全转录组分析已被广泛用于比较常见的分子信号通路并识别与肾纤维化相关的新型介质。类器官模型提供了快速测试因果关系和对此类推定介质进行机制分析的优势。如上所述，使用我们的NGS数据的基因集富集分析显示了炎症通路的富集，包括JAK/STAT信号。JAK/STAT通路的表达增强先前已在糖尿病肾病患者肾小球和肾小管间质样本中观察到[28]。在单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化小鼠模型中，使用特异性STAT3抑制剂S31-201治疗可减轻纤维化，提示JAK/STAT抑制对纤维化肾病的治疗潜力[29]。尽管药理学JAK/STAT抑制已被证明可以改善糖尿病肾病患者蛋白尿和其他生物标志物[10]，但仍缺乏在人类中直接抗纤维化作用的明确机制证据和组织学证据。因此，我们旨在使用我们的人源类器官模型表征JAK/STAT信号在肾纤维发生中的作用。KEGG通路中的富集分析显示，在纤维化类器官中JAK/STAT信号显著富集（图4A）。图4B显示了16个核心富集基因。通过qRT-PCR进一步验证了STAT-3在纤维化类器官中的上调（图4C）。然后，在从第21天到第26天诱导纤维化期间，我们使用小分子tofacitinib（JAK1和JAK3的抑制剂）抑制JAK/STAT，并在第26天通过qRT-PCR和免疫荧光分析对类器官进行分析。qRT-PCR显示STAT-3下调，证实了tofacitinib联合处理有效抑制JAK/STAT（图4C）。第26天的免疫荧光分析显示纤维化减轻，α-SMA⁺肌成纤维细胞减少，证明了JAK-STAT抑制具有直接的抗纤维化作用（图4D），这进一步强调了JAK-STAT信号在TGF-β介导的肾纤维发生中的重要作用。
5.PIM1作为肾纤维化推定介质和治疗靶点的表征
更多结果和补充图表：doi：10.1186/s13287-026-05030-4
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