阿尔茨海默病（AD）缺乏疾病修饰疗法，表观遗传失调尤其是组蛋白甲基转移酶G9a异常激活成为新靶点。本研究报道了首个SAM竞争性、高选择性、脑渗透性G9a抑制剂FLAV-27。通过X射线晶体学解析FLAV-27与G9a SET域的共晶结构（PDB:9LUS），证实其占据SAM结合口袋，依赖疏水相互作用，对G9a的选择性优于GLP 30倍以上（IC50=0.6 nM）。在CL2006线虫中，FLAV-27（1μM）减少Aβ聚集约45%，延长平均寿命22%，并提高线粒体耗氧率。在SAMP8（晚发型AD）和5xFAD（早发型AD）小鼠模型中，口服FLAV-27（5 mg/kg/天）4周显著改善新物体识别、物体位置和社会交往记忆，增加树突棘密度和AMPAR介导的mEPSC幅度。多组学分析（ChIP-seq、scRNA-seq、蛋白质组学）显示FLAV-27全局性降低H3K9me2和H3K18me1-3，上调突触可塑性基因（Arc、Syt4），下调神经炎症因子（IL-6、TNF-α）和铁死亡标志物（MDA、ROS、Fe²⁺）。重要的是，AD患者血浆和脑组织中H3K9me2和SMOC1水平升高，与认知评分负相关，支持其作为治疗监测生物标志物。本研究为AD表观遗传治疗提供了候选药物FLAV-27。
今天给大家解读一篇4月发表在《Molecular Therapy》上的题目为“First-in-class SAM-competitive G9a inhibitor FLAV-27 as a disease-modifying therapy for Alzheimer disease.”的文章。本文报道了FLAV-27的发现和临床前验证，它是一种首创新型的、竞争性抑制SAM结合位点的、脑渗透性且选择性抑制组蛋白甲基转移酶G9a的小分子。结构研究确认其独特的SAM结合模式赋予高特异性。体外实验显示其减少Aβ和p-tau聚集并恢复神经突复杂性。在线虫和小鼠模型中改善运动、寿命、线粒体呼吸和认知记忆功能。多组学分析揭示其对H3K9me2/H3K18me介导的抑制、铁死亡易感性和AD生物标志物的全局性调控作用。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《首个同类的SAM竞争性G9a抑制剂FLAV-27作为阿尔茨海默病修饰疗法》First-in-class SAM-competitive G9a inhibitor FLAV-27 as a disease-modifying therapy for Alzheimer disease
发表期刊：Molecular Therapy
影响因子：12
研究背景：
阿尔茨海默病以进行性认知减退为特征，其病理生理涉及多因素，包括表观遗传失调。既往G9a/GLP抑制剂存在选择性不足或生物利用度差等问题，亟需更优的表观遗传修饰药物。FLAV-27正是针对这一需求而开发。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 药物设计与验证
设计并合成SAM竞争性G9a抑制剂FLAV-27，通过结构研究确认其结合模式与特异性。
- 体外药效评估
在细胞模型中检测FLAV-27对Aβ和p-tau聚集及神经突复杂性的影响。
- 模式生物验证
- 动物模型验证
在晚发型AD（SAMP8）和早发型AD（5xFAD）小鼠模型中评估记忆、社交行为和突触结构。
- 机制与生物标志物分析
通过多组学分析H3K9me2/H3K18me修饰变化、铁死亡相关通路以及血浆/脑中AD生物标志物（SMOC1、H3K9me2、p-Tau181）的水平。
研究亮点：
- 首个SAM竞争性G9a抑制剂
与既往G9a/GLP抑制剂不同，FLAV-27通过独特的SAM结合模式实现高特异性和避免脱靶效应。
- 跨模型疗效验证
在秀丽隐杆线虫（改善运动、寿命、线粒体呼吸）、晚发型AD小鼠模型SAMP8和早发型AD小鼠模型5xFAD中均观察到记忆、社交行为和突触结构的恢复。
- 多组学机制解析
证实FLAV-27能全局重编程H3K9me2/H3K18me介导的转录抑制，降低铁死亡易感性，并使血浆和脑中AD相关生物标志物（SMOC1、H3K9me2、p-Tau181）正常化。
研究结果：
- 体外
FLAV-27减少Aβ和p-tau聚集，恢复神经突复杂性。
- 线虫
- 小鼠模型
在SAMP8和5xFAD小鼠中，FLAV-27显著改善记忆表现、社交行为和突触结构。
- 机制
多组学揭示全局性H3K9me2/H3K18me介导的转录抑制重编程，降低铁死亡易感性；血浆和脑中SMOC1、H3K9me2和p-Tau181水平恢复正常。
研究总结：
FLAV-27是一种有前景的表观遗传治疗药物，具有疾病修饰潜力，并在AD中实现转化生物标志物的一致性。其独特的SAM竞争性抑制模式、高选择性、脑穿透性以及在多个模型中的治疗效果，使其有望成为AD的新一代疗法。未来需进一步推进临床研究，验证其在患者中的安全性和疗效。
结果译文：
基于先前鉴定新型表观遗传调节因子的努力，我们采用基于结构的设计策略来发现新的G9a抑制剂。有趣的是，出现了一个有前景的化学类型，其特征是以1,4-氧氮杂环为中心骨架，两侧连接哌啶环和芳基部分。该骨架作为药物化学研究的基石，用于优化效力、选择性和脑渗透性（关于合成、表征和构效关系的详细信息见图S1A-S1E和表S1-S5）。在初步评估中，所有化合物均以外消旋混合物形式进行分析。
在初始阶段，对连接哌啶的芳基环进行了修饰。测试了间位、对位和邻位上广泛的取代基（表S1）。大多数类似物显示出弱活性或无活性（半数抑制浓度>1μM），但有几种化合物，如2（间-NH₂）、4（间-CO₂CH₃）、10（对-OH）、12（对-Cl）和17（邻-OH），显示出低纳摩尔范围的抑制作用。这些结果表明间位羟基在实现强效抑制中的关键作用。
随后，将间羟基苯基替换为各种杂环（表S2），但没有一个类似物保留纳摩尔活性。同样，将哌啶环收缩为吡咯烷完全消除了活性，这可能是由于构象变化和产生新的立体中心所致。
进一步的工作集中在氧氮杂环核心上。用吗啉环替换（表S3）产生了类似物32和35，其活性降低但仍可测量。氧氮杂环内氮原子的甲基化（表S4）显著削弱了效力，苄基部分的修饰也是如此。在后者中，只有化合物47（对氯苄基）表现出接近参考化合物的活性（IC50=1.7±0.1 nM；表S5）。
最终，通过这一迭代过程产生了最有前景的化合物。化合物1（本文称为FLAV-27）具有间羟基苯基、哌啶连接基、1,4-氧氮杂环核心和苄基取代基。它表现出最高的效力（IC50=0.6±0.001 nM）和对GLP优异的选择性（1μM时抑制率为3.2%）。FLAV-27也超过了标准G9a抑制剂如UNC0638（IC50=11.1±8 nM）和UNC0642（IC50=6.6±4.7 nM）的性能，对G9a显示出更高的选择性。需要注意的是，UNC0642和UNC0638都不是选择性的，因为研究表明它们同时抑制G9a和GLP。此外，使用半制备型手性高效液相色谱对外消旋FLAV-27进行了对映体分离，在吸收、分布、代谢和排泄特性方面未观察到显著差异（关于手性分离步骤和ADME表征的详细信息见补充信息）。
另一个重要发现是其令人印象深刻的选择性谱。FLAV-27对G9a表现出高选择性，在1μM浓度下对包括H3K9（SUV39H1、SUV39H2和SUV420H1）、H3K27（EZH2）、H3K4（SETD7和MLL）、H3K79（DOT1L）和H4K20（SETD8）在内的32种HMT以及多种蛋白精氨酸甲基转移酶的抑制率均低于15%（图S1F）。此外，FLAV-27在10μM浓度下对50种脱靶激酶也无抑制活性，支持其干净的选择性谱（图S1G）。这一发现尤为重要，因为其他被认为选择性的甲基转移酶抑制剂（如UNC0638和UNC0642）会同时抑制G9a和GLP。
1.X射线晶体学检查FLAV-27在人G9a SAM位点的结合
G9a抑制剂可以干扰赖氨酸结合位点或SAM（甲基供体）的结合位点。靶向后者的抑制剂被称为SAM竞争性抑制剂。在固定浓度含赖氨酸的H3肽和增加SAM浓度（0-7μM）的条件下进行的酶动力学分析显示，FLAV-27显著降低了最大速度Vmax（图1A）。与其低IC50一致，即使是在测试的最低FLAV-27浓度（1 nM）下，Vmax的下降也已显著（图1A）。非选择性G9a抑制剂UNC0642未降低酶的最大速度（图1B），表明其与G9a的相互作用机制与FLAV-27不同。这意味着UNC0642和FLAV-27结合在酶的不同位点。此外，FLAV-27和UNC0642的联合处理未产生对G9a活性的协同抑制作用（图S6C和S6D），进一步支持了非重叠结合位点的假设。为了阐明FLAV-27的精确结合模式，我们采用了结构生物学方法，成功解析了人G9a酶与FLAV-27复合物的晶体结构。鉴于FLAV-27结合在SAM结合位点，它将赋予前所未有的选择性，并将FLAV-27定位为第一个直接阻断共底物结合从而抑制甲基转移和整体酶活性的G9a抑制剂。
在材料和方法中详述的条件下获得了蛋白质-抑制剂晶体（更多细节见补充信息，包括结晶条件和数据收集参数）。随后的X射线晶体学分析显示为同源二聚体结构，抑制剂占据每个原聚体的结合口袋（图1C-1E和图S2；表S6）。图1C中报道的活性位点类似于由G9a的SET域（人序列残基913-1,193）和GLP的SET域（人序列残基982-1,266）形成的异源二聚体报道的结构（PDB:5TTF）。
对于已报道的G9a SET-SAM复合物结构（PDB:5TTF），SAM共底物的位置由Xiong等人确定。5TTF晶体结构揭示FLAV-27占据与SAM相同的结合口袋（图1D）。然而，结合模式不同，因为FLAV-27的结合主要由疏水相互作用驱动（图S2D和S2E），而SAM则形成更广泛的氢键网络（图1E）。值得注意的是，FLAV-27中哌啶环的氮原子与Tyr1154的羟基和Ser1084的主链羰基形成氢键（图1D）。这些相互作用在SAM结合结构中不存在，可能有助于增强FLAV-27结合的稳定性。
此外，FLAV-27中酚环的羟基与Tyr1085的侧链羟基形成氢键，这种相互作用在SAM复合物中也观察到。FLAV-27的酚环还通过与Trp1050和Phe1110的疏水接触进一步稳定（图1C），这些相互作用在G9a SET-SAM结构中不存在。这些接触可能是FLAV-27更强结合的基础。最后，FLAV-27的苄基环深入埋在G9a的疏水口袋内，形成显著的疏水相互作用。G9a-FLAV-27复合物中这种增加的疏水贡献很可能解释了其增强的结合亲和力，并可能是其更强抑制效力的基础。
事实上，图1F-1H和图S2F-S2J解释了G9a和GLP之间的差异。G9a和GLP蛋白的活性位点看起来非常相似，但它们的表面电荷分布不同。G9a的SCD清楚地表明SAM结合位点是疏水的，几乎没有负电荷分布，而GLP的SAM结合SCD大多是带正电的。这可能是疏水性FLAV-27化合物偏向结合G9a而非GLP的原因。
2.热力学和结合能分析揭示了FLAV-27对G9a优于GLP选择性的结构基础
为了阐明FLAV-27优先结合G9a的热力学决定因素，对G9a-FLAV-27和GLP-FLAV-27复合物进行了分子动力学模拟，随后进行了基于MM-GBSA的结合自由能计算，评估每个复合物的稳定性并建立FLAV-27对G9a优于GLP选择性的逻辑。G9a-FLAV-27复合物的计算结合自由能在整个500纳秒轨迹中保持高度稳定，平均值约为-71.017 J/mol，表明相互作用稳健且能量有利。相比之下，GLP-FLAV-27复合物表现出显著较弱的结合自由能，稳定在约-40 J/mol，平均值为-38.236 J/mol（图2K）。一致地，计算出的平衡常数自然对数进一步反映了这种差异，G9a-FLAV-27复合物的值为28.191，GLP-FLAV-27复合物的值为15.236（图S2K）。两个复合物之间ΔG和In K值近两倍的差异突显了FLAV-27对G9a相比GLP具有显著更高的热力学稳定性和亲和力。这些计算结果与实验数据高度一致，验证了FLAV-27对G9a的优越选择性源于SAM结合口袋内更有利的能量和构象稳定。
在我们之前使用SAMP8衰老模型的实验中，我们观察到了与组蛋白甲基化相关的表观遗传变化。为了更好地了解表观遗传景观并评估FLAV-27的体内有效性，我们首先测量了皮质组织中的全局组蛋白甲基化谱。正如预期，用FLAV-27处理的SAMP8小鼠在大脑中显示出显著降低的H3K9me2水平（图2A和2B），证实了G9a主要酶活性的有效抑制。由于G9a也参与甲基化其他组蛋白位点，我们将分析扩展到包括额外的表观遗传标记。FLAV-27处理特异性地逆转了H3K18me1/2/3的异常水平（这些修饰先前与G9a功能相关），而不影响H3K23me1/2/3（图2A和2B）。
为了全面了解这些表观遗传变化，我们对来自对照SAMP8小鼠和FLAV-27处理的SAMP8小鼠的皮质组织进行了H3K9me2的染色质免疫沉淀测序分析。该方法使我们能够绘制FLAV-27诱导的表观遗传改变图谱，并识别在衰老过程中G9a调节的抑制性组蛋白标记H3K9me2动态变化的基因组区域。我们的结果显示，FLAV-27处理的样本中H3K9me2水平整体下降，如图2C所示。此外，在peak calling中使用的各种FDR阈值下，FLAV-27处理的样本始终显示出较少的H3K9me2峰（图S3A），剩余的峰表现出显著降低的H3K9me2富集（图2C和2D）。尽管大多数峰在FLAV-27处理后甲基化减少（图2E），我们特别关注了H3K9me2减少最强的峰（图2F和2G）。为了评估这些变化的功能意义，我们识别了其启动子最接近这些下调峰的基因（图2H）。然后我们对该基因集进行了基因集富集和GO分析。验证我们的方法，这些基因与ENCODE数据集中已知的抑制性组蛋白修饰重叠（图S3B），支持FLAV-27广泛影响异染色质组织的观点。值得注意的是，在FLAV-27处理后，与突触结构和功能相关的GO术语显著富集（图2I）。根据GO富集分析，参与突触可塑性和结构突触发育的通路，如“突触组装”、“突触结构或活性的调节”和“突触组装的正调节”，在FLAV-27处理的SAMP8小鼠中显著上调。这些控制树突生长、受体运输和突触强化的通路包括关键基因，如Gria1、Shank3、Snap25、Slitrk5/6和Dlgap1。与突触前和突触后组织相关的术语的富集也表明突触间隙两侧的协调重建，这对于有效的神经传递至关重要。此外，GO术语如“认知”和“突触可塑性的调节”的存在，与高级神经过程一致，提示FLAV-27组中潜在的行为和记忆改善（图2I）。相反，与适应不良的神经可塑性和抑制性突触信号受抑制相关的通路在FLAV-27处理后被下调。参与“抑制性突触组装”、“GABA能突触传递”和“GABA信号”的基因，如Gabra1、Gad1、Gabrg2和Slc6a1，受到显著影响。这表明FLAV-27通过抑制功能失调的抑制性回路来增强突触可塑性和兴奋/抑制平衡。此外，FLAV-27似乎通过表观遗传学间接沉默神经炎症通路，如与炎症和氧化应激相关的基因下调所示。对氧化还原敏感基因的抑制可能减弱促退行性变氧化通路，尽管铁死亡本身并未富集。与抑制性和炎症信号相关的基因减少指向神经保护反应（图2J）。此外，低甲基化区域附近的许多序列被转录为非编码RNA（图2K），提示FLAV-27可能影响功能仍 largely unknown 的调节性RNA物种的表达。引人注目的是，与H3K9me2丢失区域相关的基因富集在与血清素信号、神经系统过程调节、焦虑和对恐惧的行为反应相关的功能中（图2L和2M），表明在这个衰老加速的SAMP8模型中先前报道的中枢损伤与表观遗传特征相关。与这些发现互补，对死后人脑组织的组蛋白修饰进行了蛋白质印迹分析。在AD脑中观察到H3K9me2和H3K18me1/2/3水平升高，而H3K23甲基化状态未检测到显著变化（图2N和2O）。
4.原代神经元培养中Aβ1-42、tau和p-tau聚集及神经突完整性的调节
AD的特征是有毒蛋白聚集体的积累，包括Aβ和高磷酸化tau，它们破坏神经元功能并导致突触退化和认知下降。为了初步探索FLAV-27的潜在神经保护特性，我们进行了体外实验，使用混合神经元和原代小胶质细胞培养物，先用Aβ1-42（500 nM）、tau（1μM）或p-tau（1μM）蛋白聚集体处理48小时，再用FLAV-27（1μM）处理24小时。结果显示，FLAV-27处理后Aβ1-42、tau和p-tau聚集显著减少（图3A-3C）。此外，在相同处理条件下，通过免疫细胞化学分析了原代皮质神经元培养物中的神经突模式。数据显示，暴露于Aβ1-42、tau或p-tau聚集体后神经突形成显著丧失，而FLAV-27处理在很大程度上逆转了这一现象（图3D-3F）。
我们通过使用FLAV-27以及AD的非哺乳动物和哺乳动物模型（被广泛接受为测试潜在抗AD药物效力的工具）来检验选择性抑制G9a是否能有效恢复中枢损伤。
FLAV-27在CL2006转基因秀丽隐杆线虫品系上进行了测试，该品系通过在肌肉细胞中表达人Aβ1-42而产生年龄依赖性麻痹。FLAV-27处理减轻了运动功能障碍（图3G），表明其具有减轻Aβ相关表型的潜力。值得注意的是，CL2006蠕虫表现出升高的H3K9me2水平和set-25（人G9a/EHMT2的直系同源物）表达增加，将表观遗传失调与Aβ病理联系起来。与赋形剂相比，FLAV-27（1μM）处理显著降低了H3K9me2/H3比值，而参考抑制剂UNC0638仅显示非显著性的降低趋势（图3H和3I）。此外，与赋形剂组相比，FLAV-27使Aβ聚集减少约45%，超过了UNC0638的效果（约26%减少）（图3J和3K）。为了评估其对生物体寿命的潜在影响，我们对CL2006蠕虫进行了生存分析。尽管未观察到总体寿命的显著差异，但FLAV-27使CL2006品系的平均寿命延长了高达22%（图3L和3M）。
FLAV-27还在衰老加速的SAMP8模型（被认为是晚发型AD模型）中进行了测试，在该模型中非选择性甲基转移酶抑制剂已被证明有效。这些实验对于优化和标准化药物给药方案、确保最佳递送和可重复性是必要的。给药在4月龄开始，因为该时间点对应于SAMP8小鼠模型中年龄相关认知衰退的早期症状阶段。FLAV-27以5 mg/kg体重每天一次口服给药，持续1个月（图4A）。为了评估FLAV-27对工作记忆的影响，进行了新物体识别测试。在熟悉阶段（图S3C），FLAV-27对总探索时间没有影响。重要的是，FLAV-27处理导致短期（训练后2小时测量）和长期（训练后24小时测量）物体识别记忆的显著改善，如NORT表现所示（图4B和4C）。类似地，在物体位置测试的适应阶段，FLAV-27处理未改变探索时间（图S3D）。此外，在OLT期间观察到辨别指数的显著增强（图4D）。
为了更深入地了解选择性G9a抑制如何改善SAMP8模型中的认知功能，对赋形剂处理组和FLAV-27处理组动物的皮质脑切片进行了Golgi染色。该技术能够对单个神经元进行详细的形态学分析，重点关注突触可塑性的两个关键指标：树突棘密度和神经元分支复杂性。使用Sholl分析（一种已知的神经解剖学方法）测量树突复杂性，该方法包括在神经元胞体周围放置同心圆并计算距中心不同距离处的树突交叉数。该方法提供了树突分支的可靠测量，这与神经元的突触整合能力密切相关（图4E和4F）。值得注意的是，与对照组相比，FLAV-27处理的动物显示出树突棘密度和神经元交叉数的显著增加（图4E-4G）。这些结果支持了体外研究先前提出的假设，即选择性G9a抑制促进神经元可塑性。重要的是，树突结构的改善与SAMP8模型中认知缺陷的逆转相关，强化了G9a抑制剂治疗年龄相关神经退行性疾病的治疗潜力。
Aβ水平与行为异常和认知下降相关；因此，我们评估了大脑中Aβ42/Aβ40比值。FLAV-27处理后，SAMP8小鼠大脑中Aβ42/Aβ40比值降低（图4H）。FLAV-27处理后Aβ42水平也降低（图4I），而Aβ40水平保持不变（图4J）。
FLAV-27处理还诱导了与突触可塑性和神经炎症相关的基因表达的显著变化（图4K和4L）。具体而言，FLAV-27给药增加了Syt4和Arc的表达，这两个基因在突触功能、神经递质释放和活性依赖性神经元重塑中至关重要。这些标志物在海马中的增加提示突触完整性和认知韧性的潜在增强。同时，FLAV-27处理导致Il-6和Tnf-α表达显著降低，这些是在神经退行性疾病中升高并与AD进展相关的关键促炎细胞因子。这些发现表明FLAV-27在衰老的AD大脑中支持突触基因程序并发挥抗炎作用。
此外，为了探索G9a抑制对突触传递的影响，我们测量了来自敲入小鼠的原代皮质神经元在暴露于FLAV-27后的AMPAR介导的自发微型兴奋性突触后电流。为了分离AMPAR-mEPSC，在灌流液中加入D-AP5和印防己毒素以分别阻断NMDA和GABAA受体。FLAV-27处理24小时显著增加了mEPSC幅度，提示突触后AMPAR表达增强（图4M）。相比之下，mEPSC频率保持不变，表明无突触前改变（图4M）。这些发现表明FLAV-27促进神经元可塑性（图4N）。
6.FLAV-27显示出高效的脑渗透性和优异的药代动力学特征
尽管有前景的临床前效果，许多赖氨酸甲基转移酶抑制剂由于差的药代动力学特征，特别是低脑穿透性和不足的口服生物利用度，未能在中枢神经系统疾病中取得进展，这严重限制了它们的体内治疗实用性。为了解决这些问题，我们使用平行人工膜渗透性试验评估了FLAV-27及相关类似物的体外渗透性。FLAV-27超过了Di等人设定的高BBB渗透性阈值（Pe>5.16×10⁻⁶ cm·s⁻¹）。此外，预测它比UNC0638更有效地穿越BBB（Pe=6.2±0.3×10⁻⁶ cm/s）（表S7和S8）。对映体与外消旋混合物之间未观察到活性的显著差异（关于合成、表征和构效关系的详细信息见补充信息）。
接下来，我们通过使用SAMP8小鼠模型的详细药代动力学研究评估了FLAV-27的中枢神经系统成药性。口服碱基化合物后，FLAV-27在15分钟内达到血浆峰浓度（Cmax=441±68 ng/mL），而同一时间点的脑浓度高出3.8倍（1,688±527 ng/mL）。脑浓度继续增加，在30分钟达到峰值（Cmax=2.25±1,086 ng/mL），显示出快速且持久的CNS暴露。腹膜内给药后观察到类似结果，脑水平比血浆水平高5.9倍（图S4A和S4B）。这些结果与体外PAMPA测定一致，确认了有效的被动渗透性和口服吸收。
为了克服碱基形式的局限性，特别是与沉淀和释放差相关的问题，我们创建了一种盐制剂，其生物利用度显著提高。与碱基形式相比，盐版本的Cmax增加了7.9倍，AUC₀₋ₗₐₛₜ增加了100倍，Tmax从30分钟移至120分钟。AUC₀₋ₗₐₛₜ的大幅增加（反映从给药到最后可测量时间点的总药物暴露）表明全身可用性显著增强。这种增强导致了高的中央分布容积，提示广泛的组织渗透，包括在大脑中持续水平。这种脑-血浆比值和脑分布容积对于CNS疗效至关重要，并进一步支持FLAV-27作为脑渗透性治疗候选药物的潜力（表S9）。
尽管疗效和脑递送对CNS候选药物至关重要，但临床前安全性仍然是临床推进的基本要求，特别是在需要长期暴露的慢性CNS疾病背景下，需要有利的安全性特征。相比之下，由于疾病的严重性和紧迫性，对肿瘤适应症的安全性标准可以更宽松。虽然不是本研究的主要焦点，我们进行了有针对性的毒理学评估，以确认FLAV-27未显示明显的毒性、脱靶效应、差的药代动力学或长期危害的潜力。
在高达10μM（有效剂量的10倍）的浓度下，FLAV-27显示出最小的脱靶效应，对大多数非G9a靶点的抑制低于50%（图S4C）。遗传毒性测试，包括Ames试验和微核形成评估，显示在高达25μM的剂量下没有致突变或致断裂效应的证据（图S4D；表S10）。在急性毒性研究中，未观察到不良作用水平被确定为1 g/kg（口服），没有器官损伤或体重下降的迹象（图S5）。14天每天100 mg/kg的亚慢性暴露同样耐受良好，未观察到明显毒性（图S6）。
这些数据共同支持FLAV-27的强大药理学特征，其特点是高效的脑渗透性、通过盐制剂增强的口服生物利用度，以及无明显毒性。这些特性适合有效的CNS靶向，这是甲基转移酶抑制剂中罕见但至关重要的特性。
为了进一步表征FLAV-27在SAMP8 AD小鼠模型中的分子效应，我们从赋形剂处理和FLAV-27处理小鼠的海马组织样本开始进行了批量RNA测序。差异表达基因的分析揭示了与G9a抑制一致的去抑制模式（图5A）。上调基因的GO富集分析表明与免疫相关通路有强关联（图S3E）。此外，我们应用RNA-Age Calculator工具基于转录组数据估计处理组和对照组动物的分子年龄。尽管由于样本量限制差异未达到统计学显著，FLAV-27处理的小鼠相比对照组显示出降低的分子年龄趋势（图S3F）。
为了进一步剖析这些转录组变化背后的细胞类型特异性机制，我们采用了单细胞RNA测序。与捕获异质组织中平均基因表达的批量RNA-seq不同，scRNA-seq能够在单个细胞水平上检查转录动态。这种方法使我们能够表征细胞异质性并识别对FLAV-27处理特别响应的不同细胞群。通过这一分析，我们旨在查明受选择性G9a抑制影响的关键细胞类型和分子通路，从而推进我们对FLAV-27在AD中治疗潜力的理解。
基因表达分析揭示了响应FLAV-27处理的显著转录变化。我们成功地从SAMP8对照中测序了6,316个细胞，每个细胞中位UMI为1,215个，从FLAV-27处理的小鼠中测序了11,919个细胞，每个细胞中位UMI为1,050个。基于转录谱的后续聚类分析在对照组和FLAV-27组中识别出不同的细胞类型（图5B和5C）。值得注意的是，在分析细胞类型组成时，我们观察到FLAV-27处理后小胶质细胞（已知的疾病驱动因素）减少了2倍（图5D）。值得注意的是，FLAV-27处理小鼠中的神经元显示出指示增强突触功能的转录谱，与我们之前关于FLAV-27支持神经元活性的发现一致。有趣的是，在对照样本中，簇1显示出小胶质细胞和星形胶质细胞活化的特征，反映了在AD中观察到的特征性促炎环境。相反，FLAV-27处理样本中的簇1显示出与突触传递和神经系统发育通路相关的基因表达谱（图S3G和S3H）。最显著的上调通路包括突触囊泡介导运输调节、突触组装、突触后组织、突触结构或活性以及突触信号释放。此外，与调节神经炎症反应相关的GO术语——如胶质细胞发生、细胞因子产生调节和对IL-1的应答——被富集，并伴有Serpine1、Nfkbia和Ccl3等基因表达增加。涉及氧化还原平衡和铁相关应激反应的基因变化提示FLAV-27可能间接抑制铁死亡，从而有助于其神经保护效应，尽管铁死亡相关的GO术语未直接富集。总体而言，这些发现强调了FLAV-27如何激活一个促进突触完整性、认知功能和炎症调节的转录程序，同时可能减少神经退行性疾病的发病。FLAV-27在衰老大脑中保存或恢复兴奋性神经传递和记忆功能的潜力得到与谷氨酸能突触相关基因的强有力支持（图S3I和S3J）。
相应地，DEGs分析显示FLAV-27处理的样本独特地表达了涉及谷氨酸能和血清素能突触以及长时程增强的基因，支持FLAV-27增强对学习和记忆至关重要的过程的观点（图S3K）。GO富集分析表明，FLAV-27诱导的基因与神经元发育、神经元分化调节和神经元迁移相关（图S3L），与我们之前观察到的FLAV-27在促进树突生长和改善记忆中的作用一致。
为了完善我们对细胞类型特异性转录反应的理解，我们分析了每个已识别细胞群中表达最高的基因（图5E、5F、S3G和S3H）。虽然两组之间小胶质细胞标志物的总体丰度相似（正如scRNA-seq分析中所预期的），但FLAV-27处理样本中这些标志物的表达水平较对照组降低，表明FLAV-27在不改变群体大小的情况下调节小胶质细胞基因表达。
为了验证这些转录组学发现，我们从关键细胞类型（特别是神经元）中选择了几种与AD病理相关的DEG，并评估了它们在FLAV-27处理后的表达。所有选定的基因在FLAV-27给药后均表现出表达增加，确认了我们scRNA-seq结果的稳健性（图5G和S3M）。
鉴于观察到的小胶质细胞基因表达调节，我们进一步研究了FLAV-27对人iPSC衍生小胶质细胞的功能影响。用FLAV-27（1μM）处理的细胞评估了细胞因子分泌和吞噬活性（图5H）。在基础条件下，FLAV-27和参考G9a抑制剂UNC0642均未显著改变大多数靶标的细胞因子分泌。有趣的是，UNC0642诱导了IL-1β分泌的显著增加，而FLAV-27未观察到这种效应（图5H），提示可能导致不同小胶质细胞反应的不同作用机制。值得注意的是，由于小胶质细胞摄取Aβ1-42是AD病理中的关键事件，我们使用流式细胞术评估了该过程。FLAV-27显著增强了iPSC衍生小胶质细胞对Aβ1-42寡聚体的摄取（图5I）。用UNC0642预处理未观察到这种效应，进一步支持了FLAV-27调节小胶质细胞功能的独特潜力及其作为治疗候选药物的前景。为了进一步评估FLAV-27的抗炎效应，我们测试了其对暴露于LPS的胶质细胞的影响。FLAV-27预处理在LPS攻击的HEK293T细胞中保持了细胞活力（图S7A），并在原代星形胶质细胞和小胶质细胞培养中显著降低了亚硝酸盐产生，优于UNC0642（图S7B和S7C）。这些结果进一步证实了FLAV-27的抗炎和神经保护潜力。
最后，在我们scRNA-seq数据集中验证的DEG中，有些与铁死亡通路相关，促使我们探索这种受调节的铁依赖性细胞死亡形式，它越来越多地与AD相关联。支持其相关性，与衰老抵抗的SAMR1菌株相比，铁死亡标志物在SAMP8小鼠中显著升高（图S7D-S7H），表明在该AD模型中对铁死亡的易感性增强。与此一致，SAMP8小鼠中FLAV-27处理导致Gpx4和Fsp1（两个分别通过谷胱甘肽依赖和独立机制起作用的铁死亡抑制基因）的显著上调（图5J）。此外，FLAV-27恢复了氧化还原平衡，表现为更高的GSH:GSSG比值和降低的ROS、Fe²⁺和MDA水平，与赋形剂处理的对照相比（图5K-5N）。
为了评估FLAV-27对线粒体功能和氧化应激的影响，我们转向C. elegans CL2006模型，该模型能够进行体内高分辨率代谢分析（图5O和图S7I-S7L）。Seahorse分析显示，FLAV-27显著改善了线粒体呼吸，在CL2006蠕虫中使基础和线粒体耗氧率提高高达36%（图5P-5S）。FLAV-27还针对tert-丁基过氧化氢诱导的氧化应激提供了保护，存活率接近维生素C处理的对照（图S7M）。此外，在AD模型中升高的氧化应激响应基因sod-1的表达被FLAV-27处理正常化（图S7N），提示改善的氧化还原稳态。
最后，为了评估转化相关性，我们检查了AD患者的死后脑组织。虽然GPX4和FSP1转录水平与对照组无显著差异（图S7O），但在AD患者的组织中存在氧化应激和铁死亡易感性的标志物，包括GSH:GSSG比值降低以及ROS、Fe²⁺和MDA水平升高（图5T-5W）。
为了评估G9a选择性抑制是否能带来对抗AD的新特性，我们旨在测试FLAV-27对认知和疾病进程的影响。在5xFAD转基因小鼠模型（一种成熟的EOAD模型）中评估了FLAV-27的效果。实施了两种治疗方案：（1）早期干预方案，旨在模拟预防性治疗；（2）晚期干预方案，模拟在已建立疾病状态下的治疗。图6A的设计使我们能够评估对认知的症状性影响（使用标准行为学测定）以及FLAV-27在遗传性EOAD转基因小鼠模型中作为疾病修饰剂的潜力。使用NORT评估这些动物的认知能力。结果显示，FLAV-27治疗显著改善了短期和长期记忆（图6B、6C和图S8A）。两种FLAV-27方案均提供了认知益处。尽管缺乏显著性，早期治疗显示出预防认知缺陷的趋势。重要的是，FLAV-27未影响运动活动，因为旷场测试中的总移动距离保持不变（图6D和图S8B-S8H）。站立行为量仅在FLAV-27处理的动物中减少（图6E），而理毛行为在处理后未改变，仅在两个对照组之间观察到显著差异（图S8I）。为了检查空间记忆，我们进行了OLT（图6F和图S8J），结果显示所有药物干预后辨别指数均显著增强。值得注意的是，两种FLAV-27治疗方案均导致比WT对照组更高的DI值，提示FLAV-27具有强大的认知增强效应。此外，使用三箱社交互动测试通过记录嗅闻时间评估社交能力（图6G、S8K和S9L）。WT对照组和两个用FLAV-27处理的5xFAD组表现出更长的嗅闻时间，表明与5xFAD对照组相比社交能力有所改善（图6G）。Aβ的组织病理学分析（图6H-6I）显示，FLAV-27显著减少了海马（图6H）和皮质（图6I）中的Aβ斑块数量。此外，FLAV-27处理显著增加了树突棘长度（图6K和6M），并且，重现了在SAMP8小鼠中观察到的效果，FLAV-27显著增加了棘密度（图6L和6N）。
星形胶质细胞增生在5xFAD小鼠中随着年龄增长逐渐增加，与认知障碍的发病相一致。因此，进行了GFAP免疫标记以确定不同处理对星形胶质细胞增生进程的影响。该评估使用针对GFAP的免疫荧光法进行（图6O）。结果证实，与WT小鼠相比，5xFAD小鼠整个海马中GFAP免疫染色显著增加（图6P和图S8M）。在特定区域也观察到这种增加，包括DG、CA1和CA3（图6O和图S8N-S8P）。整个海马中GFAP水平的定量显示，两种FLAV-27治疗方案后均有所下降（图6P）。有趣的是，虽然在DG和CA1区域的有益效应可忽略不计（图S8N-S8P），但早期和晚期FLAV-27处理均显示海马CA3区域GFAP免疫反应性的显著降低（见图6O）。
FLAV-27恢复了即早基因Arc的表达，特别是在1+0组中，表明神经元活性和认知功能增强（图S8Q）。此外，FLAV-27显著降低了促炎细胞因子Il-6的表达（图S8R），同时上调了Ferritin轻链（图S8S），提示神经炎症信号减少和铁死亡相关保护机制的潜在激活。
为了验证AD中关键病理事件（如突触可塑性、神经炎症和铁死亡）背后的分子改变，在FLAV-27处理后进行了全面的蛋白质组学分析。WT小鼠与5xFAD小鼠在主成分分析中明显分离，处理组聚类在中间位置，提示处理部分逆转了疾病相关的蛋白质组变化（图S9A）。热图确认了各组之间不同的表达模式，5xFAD小鼠中具有特征性的蛋白质组特征，且处理条件之间存在显著差异（图6Q）。此外，全局富集分析显示，当考虑所有组时，多个生物学过程发生显著改变，表明由疾病状态驱动并通过处理调节的广泛功能差异（图S9B）。
接下来，我们比较了5xFAD和WT蛋白质组。如图S9C所示，约40%的差异表达蛋白是核或质膜蛋白，而6.5%是线粒体蛋白，强调了线粒体功能障碍对AD发病机制的潜在贡献。通路分析揭示了Hippo信号通路的减少（图S9D），该通路涉及细胞增殖和凋亡调节，以及鞘糖脂生物合成和糖胺聚糖降解的上调（图S9E），这两者都可能破坏膜组成并促进AD中的炎症和聚集。最后，为了评估处理影响，我们将每组与未处理的5xFAD小鼠进行了比较。所有处理均显著改变了蛋白质组谱（图6R、6S和图S9F），表明疾病修饰潜力。
对5xFAD蛋白质组与WT蛋白质组的详细分析揭示了与突触功能、能量代谢和蛋白稳态相关的通路中的广泛改变（图7和图S9G-S9J）。值得注意的是，5xFAD小鼠显示出参与线粒体功能、ATP合成、泛素化和RNA加工的蛋白下调，同时与先天免疫、突触修剪和炎症反应相关的蛋白上调。在膜运输、细胞骨架组织和蛋白酶体功能中也观察到其他变化，表明神经元结构和细胞内信号传导的更广泛紊乱。代谢失衡，包括鞘脂代谢、糖酵解、脂质转运和线粒体翻译的破坏，也很明显，提示能量产生和生物合成能力的缺陷。
在5xFAD小鼠中观察到的分子改变的背景下，所测试的处理调节了关键疾病相关通路中的蛋白表达。FLAV-27早期处理（1+0）上调了Grid2、Ist1和Gng3，提示恢复了在5xFAD小鼠中受损的突触信号和囊泡运输机制。晚期处理（0+1）还增加了Pigt、Cpped1、Cox14、Atp5mpl、Nf2、Ints8、Mkln1、Ube2v1、Smpd3和Ndufa3的表达，指向线粒体生物能量学、蛋白稳态和泛素化以及RNA代谢的改善——所有这些在AD中通常都是失调的。除了上调有益蛋白外，FLAV-27处理还逆转了先前发现在5xFAD小鼠中上调的几种蛋白的增加，从而靶向了与AD病理相关的通路。早期处理（1+0）降低了Dhcr24、Smarcc2、Slc12a2、Ints1、Josd2和Abcd1的水平，这些与脂质代谢、氧化还原稳态、突触基因表达和离子运输有关。
晚期处理（0+1）导致疾病升高的蛋白更广泛的下调，包括Ptpn6、Golga2、Pik3ca、Igtp、Ubb、Ctsh、Supt4a、Dhcr24、Ncbp2、Pak1ip1、B3galnt1和Ptcd1，提示广泛的治疗效应。炎症调节因子（Ptpn6和Igtp）的表达减少与scRNA-seq分析中观察到的小胶质细胞活化减弱一致。蛋白稳态相关蛋白（Ubb和Ctsh）的下调提示蛋白降解能力改善，而Golga2和Pak1ip1的减少可能表明囊泡运输和细胞骨架结构的恢复，这两者对于正确的APP加工和突触功能都是必需的。此外，Pik3ca的下调可能反映细胞生存和自噬通路的重新平衡，而Supt4a和Ncbp2（参与RNA加工）水平的降低可能表明转录失调的部分逆转。Dhcr24表达降低指向纠正的胆固醇生物合成和氧化应激调节，而B3galnt1下调可能调节影响蛋白聚集和突触信号的糖基化过程。总之，这些变化提示FLAV-27发挥多靶点神经保护效应，以与疾病修饰治疗谱一致的方式调节炎症、代谢、囊泡运输和神经元结构。
9.AD血浆生物标志物及表观遗传、突触可塑性和神经炎症相关参数的调节
我们接下来旨在将FLAV-27的效应与临床上常测得的、在5xFAD小鼠血浆中可检测到的与AD病理相关的生物标志物水平相关联。以下所有数据均来自不同实验组收集的血浆样本。
鉴于已知H3K9me2水平在5xFAD小鼠大脑中升高及其在转录抑制中的作用，我们进行了一项初步实验以确定H3K9me2是否可在血浆中检测到，以及FLAV-27是否影响其水平。如图7A所示，与对照组相比，未处理的5xFAD小鼠表现出更高的血浆H3K9me2水平。值得注意的是，FLAV-27处理显著降低了H3K9me2水平，与其作为赖氨酸甲基转移酶的预期活性一致。接下来，我们测量了血浆SMOC1水平，这是一种与Aβ斑块相关并被确定为早期AD生物标志物的突触蛋白。与对照组相比，未处理的5xFAD小鼠中SMOC1的血浆浓度显著升高。重要的是，FLAV-27处理降低了这些升高的水平，使其恢复到与对照动物相似的值（图7B）。
还评估了GFAP（星形胶质细胞活化和神经炎症的标志物）和TNF-α（一种促炎细胞因子）的水平，因为两者在AD患者血浆中均升高。正如预期，5xFAD小鼠中两种炎症标志物的血浆水平均高于WT对照（图S10A和S10B）。值得注意的是，仅在早期（1+0）FLAV-27治疗方案后，血浆TNF-α水平恢复正常（图S10B），而仅在晚期（0+1）处理后观察到GFAP血浆水平的降低（图S10A）。
然后我们旨在将早期和晚期FLAV-27治疗的潜在益处与AD相关的血浆生物标志物相关联。我们特别关注了Aβ肽、p-tau和神经丝轻链，这些是疾病病理和进展的关键指标。这些相关性对于确定FLAV-27是作为疾病修饰疗法而非仅仅提供症状缓解至关重要。为此，我们测量了Aβ肽、两种作为AD临床生物标志物的p-tau形式以及NF-L（一种公认的神经系统疾病中神经轴索损伤的标志物）的血浆水平。值得注意的是，早期（1+0）治疗方案在Aβ1-40或Aβ1-42水平或Aβ1-42/Aβ1-40比值上未显示显著变化，表明FLAV-27的预防性益处并非源于减少淀粉样蛋白负荷（图S10C-S10E）。关于被认为是可靠AD生物标志物的p-TauT181和p-TauT217，未处理的5xFAD小鼠表现出这两种标志物的血浆水平升高。值得注意的是，FLAV-27的早期（1+0）和晚期（0+1）治疗方案均逆转了这些增加，使p-tau水平恢复到WT对照中观察到的水平（图S10F和S10G）。类似地，在未处理的5xFAD小鼠中显著升高的NF-L水平，在两个FLAV-27治疗组中均恢复到对照水平（图S10H）。
最后，我们对所有评估的血浆生物标志物进行了相关性分析，重点关注H3K9me2和SMOC1，这两者均受G9a调节（图7C）。H3K9me2与SMOC1水平显示强正相关，而其他生物标志物显示出变化的趋势。值得注意的是，SMOC1也与神经炎症标志物p-tau（T181）和NF-L相关（图7C），突显了FLAV-27抑制G9a后对血浆生物标志物的多靶点调节。这一证据支持FLAV-27作为AD疾病修饰疗法的潜力。
为了评估我们发现的转化相关性，我们检查了无痴呆对照、前驱AD患者和AD痴呆患者的血浆和脑脊液中广泛的分子标志物组。AD患者中血浆H3K9me2（图7D）、p-tau（T181）和TNF-α水平显著升高（图S10I和S10J），而SMOC1水平呈升高趋势（图7E）。在脑脊液中，前驱AD和AD组中SMOC1（图7F）、总tau和p-tau（T181）的水平与对照组相比显著升高（图S10K和S10L）。AD患者的CSF Aβ42/Aβ40比值显著降低，主要是由于Aβ42减少，与淀粉样蛋白病理一致（图S10M-S10O）。通过MMSE评分评估的认知障碍（图7G）与血浆H3K9me2和脑脊液SMOC1水平呈负相关（图7H）。死后脑组织蛋白质印迹分析显示，与对照组相比，AD患者的SMOC1蛋白水平增加（图7I和7J）。此外，血浆H3K9me2水平与脑脊液SMOC1呈正相关，而脑脊液SMOC1也与tau生物标志物和炎症标志物显示出中等关联（图7H）。这些发现支持表观遗传失调和星形胶质细胞活化在人类AD病理中的作用，并突显了这些标志物作为治疗靶点和疾病指标的可能性。
更多结果和补充图表：doi：10.1016/j.ymthe.2025.12.038
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