造血干细胞（HSC）基因治疗面临细胞数量不足、体外扩增导致干性丢失两大瓶颈。本研究针对动员外周血（mPB） 来源HSC，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq） 和慢病毒条形码（LVBC）克隆追踪，系统评估了UM171扩增方案对HSC功能的影响。结果发现：UM171培养可实现mPB HSC的净维持，且部分HSC发生对称自我更新（通过不同小鼠间共享克隆标记证实）。scRNA-seq揭示扩增过程中HSC分子特征逐渐稀释，但谱系命运保持忠实。通过优化细胞因子组合（IL3+IL6中剂量）、筛选最佳培养基（SCGM）及联合SR1，新工艺EX相比传统短程培养（DPlike）显著提高移植后基因修饰细胞的载体拷贝数（VCN） 和克隆多样性。重要的是，延迟慢病毒转导（72h）会诱导衰老相关基因表达，损害HSC功能。本研究为mPB HSC基因治疗提供了临床级扩增方案，已申请ARO基因治疗临床试验（EU CT 2024-518972-30）。
今天给大家解读一篇5月发表在《Molecular Therapy》上的题目为“Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells from Human Mobilized Peripheral Blood for Gene Therapy Applications.”的文章。本文研究了动员外周血造血干细胞的体外扩增，指出常用培养方案会导致干细胞功能丧失。通过单细胞RNA测序分析，研究者确定了分化轨迹并定义了假定的HSC簇。他们开发了临床可转化的GMP工艺，通过优化细胞因子、培养基、转导时机和小分子组合，成功从儿科及成人供体的mPB中扩增LV转导的HSCs。该工艺优于脐带血扩增方案，并提供了HSC对称自我更新的证据，相关结果将应用于常染色体隐性骨硬化症的基因治疗临床试验。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《体外扩增人动员外周血中的造血干细胞和祖细胞用于基因治疗应用》Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells from Human Mobilized Peripheral Blood for Gene Therapy Applications
发表期刊：Molecular Therapy
影响因子：12
研究背景：
体外扩增动员外周血造血干细胞是推进细胞和基因治疗策略的有前景的方法，但常用培养方案会导致干细胞功能丧失。当前需要改进工艺以实现高效扩增并保持干细胞功能。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
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通过单细胞RNA测序对mPB扩增培养进行深度表征，分析分化轨迹和谱系保真性。
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定义假定的HSC簇，用于估算体外培养中的转导效率，并与异种移植和临床试验中的长期基因标记进行关联。
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开发临床可转化的GMP兼容工艺，具体改进包括：细胞因子补充、培养基选择、LV转导时机以及小分子组合以防止分化程序激活。
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使用LV整合位点分析和基因组条形码克隆追踪验证HSC对称自我更新分裂。
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将优化工艺应用于儿科患者和成人供体的mPB，并与脐带血扩增方案比较。
研究亮点：
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利用单细胞RNA测序揭示了mPB扩增培养中分化轨迹的谱系保真性。
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通过定义假定的HSC簇，实现了体外培养中转导效率的估算，并与异种移植及基因治疗患者的长时期基因标记相关。
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优化的工艺在mPB中优于经验证的最先进的脐带血扩增方案。
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LV整合位点分析和基于基因组条形码的克隆追踪提供了HSC对称自我更新分裂的确凿证据。
研究结果：
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单细胞RNA测序突出显示了分化轨迹，并在定向前体细胞中保持了谱系保真性。
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假定的HSC簇有助于估算转导效率，该效率与异种移植和基因治疗患者的长时期基因标记相关。
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优化的工艺在mPB中优于经验证的最先进的脐带血扩增方案。
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LV整合位点分析和基因组条形码克隆追踪提供了HSC对称自我更新分裂的确凿证据。
研究总结：
该研究开发并验证了一种优化后的HSC转导/扩增工艺，能够从儿科患者和成人供体的动员外周血中有效扩增LV转导的造血干细胞。工艺改进基于生物学信息，有效防止了干细胞分化。研究提供了HSC体外对称自我更新的直接证据，为基因治疗提供了可靠的细胞来源。这些结果支持在即将进行的常染色体隐性骨硬化症基因治疗临床试验（EU CT 2024-518972-30）中对该工艺进行临床测试。
结果译文：
1.UM171体外扩增实现健康供体和基因治疗患者来源的mPB HSC的净维持
为了测试先前为脐带血开发的体外扩增方案是否适用于mPB来源的HSC（在基因治疗背景下具有临床相关性的HSC来源），我们将来自儿科基因治疗试验（NCT03488394）中黏多糖贮积症I型（MPSI）患者的n=5个mPB药物产品（DP）的造血干祖细胞（HSPC），在添加了早期作用细胞因子（SFT6：干细胞因子100 ng/mL；FLT3配体100 ng/mL；促血小板生成素50 ng/mL；白介素6 50 ng/mL）的商品化培养基中，添加或不添加表观遗传修饰剂UM171，培养6至7天（图1A）。DP来源的细胞扩增了8到27倍（图1B），并且，与预期一致，与仅含细胞因子的培养相比，添加UM171增加了具有原始免疫表型的细胞比例（图1C）。
为了评估在UM171存在下扩增的MPSI患者来源DP的再殖能力（EX-U），我们在异种移植到原代（读取短期HSC功能；图1D,F）和次级（读取长期HSC功能；图1E,G）免疫缺陷受体小鼠后12周，测量了人细胞植入水平和谱系组成。在匹配的扩增前细胞剂量（“第0天当量”）下，将EX-U细胞与它们各自未扩增的DP以及用作体外操作/培养起始材料的未培养（NC）CD34+细胞进行了比较。所有条件在原代和次级受体小鼠的骨髓中均产生可检测的人细胞植入（图1D,E），并具有多谱系输出（图1F,G）。体外培养对两名患者（Pt）DP的短期HSC功能产生了不同影响：对于Pt1的DP，原代移植物大小相似（图1D左），但对于Pt2的DP，植入显著减少（图1D右）。尽管如此，两名患者的移植物能有效转移到次级受体（图1E,G），表明体外扩增的细胞保持了长期HSC潜能。
我们假设Pt2的EX-U细胞在异种移植中原代植入减少可能与慢病毒转导联合体外扩增有关，因为该患者在本研究中的DP转导程度最高，平均每个细胞的载体拷贝数（VCN）为5.2，而所有8名接受治疗的患者的中位VCN为2.2。为了进一步验证这一假设，我们用递增的LV剂量转导来自4名健康成人供体的mPB CD34+细胞，观察到与Pt2的DP类似，在体外培养期间细胞生长呈剂量依赖性下降（图1H），同时伴随免疫表型更原始的细胞绝对数量减少（图1I）。因此，体外培养可能放大由基因工程技术诱导的HSPC应激反应，特别影响短期HSC功能，下文将更详细地研究。
接下来，我们分析了慢病毒载体整合位点（LVIS），以确定Pt1中EX-U与DP来源移植物在异种移植中的克隆结构。LVIS半随机地分布在整个基因组中。因此，每个转导的单个克隆由一个或多个独特的整合位点表征，这些位点可稳定传递给后代。来自DP和EX-U的异种移植物在原代小鼠中呈高度多克隆模式，未检测到优势克隆（图1K）。正如从富集长期HSC的操作中所预期的，次级移植物在两组中都具有较低的多克隆组成，但仍未显示克隆优势的迹象（图1K）。EX-U与DP之间的定量比较显示，来自EX-U的原代移植物（而非次级移植物）具有显著更少的独特整合位点和更低的香农多样性指数，表明在体外扩增期间，来自Pt1的细胞也损失了一些短期HSC活性。次级受体的比较（评估长期HSC输出的严格方法）显示长期植入潜力得到保留（图1L）。
为了确认我们的扩增方案对成人mPB的更广泛适用性，我们将来自一名成人健康供体（HD1）的EX-U和DPlike HSPC与一个高度多样化的LV条形码文库一起转导，模拟基因治疗背景，并通过独立方法同时进行克隆移植物分析（图S1A）。以递减的第0天当量细胞剂量移植EX-U细胞，导致外周血人细胞植入呈剂量依赖性下降（图S1B）。异种移植16周后，当注射相同的第0天当量剂量时，EX-U显示出与DPlike细胞相当的植入水平（图S1C），但当剂量降至DPlike输入剂量的33%和9%时，植入水平较低但仍可检测到多谱系植入（图S1D）。基于第0天当量剂量计算的极端极限稀释分析（ELDA）估计HSC频率为1/44,318（图S1E）。我们通过两种方法评估移植物克隆性：LVIS或通过慢病毒载体条形码（LVBC）文库引入细胞的单个条形码丰度定量。两种方法一致显示，即使在中等的扩增细胞剂量下，也呈多克隆重建，且克隆丰度模式一致且惊人地相似，支持两种方法的稳健性（图S1F,G；表S1）。在等效的第0天起始细胞剂量下，EX-U组的克隆多样性和每只小鼠估计的人再殖克隆数量与DPlike组相当或更高，这与体外培养期间至少维持了长期HSC功能一致（图S1H,I）。为了证明这些HSC中的一些在体外扩增期间经历了对称的自我更新分裂，我们分别从Pt1和HD1中鉴定了独特的LVIS或LVBC，这些标记可以在注射了相同细胞治疗产品的不同小鼠中检测到（图1M）。在移植了DP（DPlike）细胞的小鼠中仅检测到背景水平的此类共享克隆，其中细胞计数在短暂的培养期间保持稳定，而在接受EX-U细胞的小鼠中，2-7%的克隆标记在老鼠之间共享（图1M；表S1）。
总的来说，这些数据表明UM171培养允许成人和儿科mPB来源HSC的净维持，可能是由于一些HSC在体外经历对称分裂，而另一些在培养过程中丢失。体外培养不会导致克隆优势，保留了克隆多样性。
2.mPB CD34+细胞的体外培养主要扩增具有保留谱系命运的定向祖细胞，并通过scRNAseq预测体内DP特征
为了表征EX-U培养期间mPB CD34+细胞的群体动态，我们对来自2名成人健康供体的细胞进行了单细胞RNA测序。在培养前、培养第4天和第8天对供体1的CD34+细胞进行分析。对于供体2，除了CD34+ bulk扩增培养外，一部分CD34+细胞通过FACS分选为富集多能HSPC（CD34+CD38-）、定向粒-单核祖细胞（GMP）或巨核-红系祖细胞（MEP）的亚群，并通过转导表达不同荧光蛋白的LV来标记每个亚群的来源，然后将亚群重新混合进行扩增（图2A）。集落形成细胞测定证实了分选后GMP和MEP的功能富集（图2B）。在批次校正和降维后，生成了一个包含所有样本单细胞转录组的单一对象。进行了无监督聚类，并手动注释了细胞状态（图2C；表S2）。与非培养细胞（可能更富集原始细胞）相比，HSC和多淋系祖细胞（MLP）在培养过程中随时间逐渐减少，而祖细胞状态、红系/巨核系、活跃循环的髓系祖细胞和肥大细胞前体（MCP）增加（图2D）。这些数据表明，扩增培养主要支持mPB来源的祖细胞生长，而不是更原始的HSC，后者在培养过程中逐渐被稀释。接下来，我们询问定向祖细胞在培养过程中是否能够保持谱系命运，还是存在可塑性。第0天分选的GMP和MEP的扩增培养输出分别忠实地映射到髓系/单核系和红系/巨核系祖细胞簇上（图2E,F）。第0天CD34+CD38-的后代缺乏最分化的状态，显示偏向髓系祖细胞区域，并在HSC簇内保持相当大比例的细胞（图2F），这与我们之前倡导将CD34+CD38-群体作为扩增培养的HSC富集起始群体的数据一致。综合起来，这些数据支持HSPC命运在扩增培养期间得以维持。
为了评估体外培养对HSPC转录组的整体影响，我们在单细胞RNA测序数据集中鉴定了HSPC群体中随时间共同失调的基因，并评估了标志性基因表达特征的富集情况（图S2A；表S2）。随时间上调的基因富集的标志包括与增殖、氧化代谢、mTORC1信号传导和脂质代谢相关的标志，而与炎症和即早反应基因相关的标志则被抑制。在培养期间，DNA损伤和衰老相关的基因特征也富集，在bulk HSPC群体中的诱导明显强于分子定义的HSC簇，在第4天达到峰值，同时TP53水平最高，并在第7天部分缓解（图S2B,C,D）。为了验证这些转录组数据，我们在培养期间（有无LV转导）对mPB CD34+细胞（n=3名供体）进行了MitoTracker染色、碱性彗星测定并测量了衰老蛋白标志物（图S2E-H）。线粒体质量增加，在第4天达到峰值，在CD34+ bulk细胞中比在原始细胞区室中更强，并且LV转导进一步加剧（图S2F）。培养也与橄榄尾矩增加相关，LV转导后有更高值的趋势（图S2G）。扩增群体中SA-β-半乳糖苷酶活性增加、脂褐质中度增加但p16INK4a减少，表明是瞬时应激反应而非不可逆衰老，且与LV转导无关（图S2H）。
为了评估细胞因子补充对培养动力学的影响，我们在scRNAseq中评估了不同细胞群体上关键细胞因子受体的表达。除了KIT和FLT3外，IL3RA在注释的最原始HSC亚群中也高表达，而IL6受体主要在HSPC和单核细胞祖细胞中检测到（图2G）。这些发现提示在mPB扩增过程中需要进一步研究IL6和IL3补充的作用（见下文）。
接下来，我们假设通过单细胞转录组学对扩增培养物进行深入表征，有助于理解当前标准放行检测可能无法完全与体内行为相关联的DP特征。尽管在中期分析中，所有接受治疗的患者都显示出令人鼓舞的代谢纠正和早期临床结果，但MPS试验中8名患者中有3名的体内VCN稳定在低于0.3的值，而药物产品的体外检测测得转导效率>60%，VCN≥1.30。异种移植准确反映了患者中稳态VCN（图S3A），从而证实了这3名患者移植后VCN的下降并非由于预处理不足。我们对来自两名代表性MPS患者（即Pt1，体外/体内VCN一致；Pt4，移植后VCN下降）的DP、第4天EX-U和第7天EX-U培养物中CD34+CD90+CD45RA+（HSC富集群体）进行了scRNAseq。通过从图2C数据集进行标签转移来注释细胞群体（图2H；表S3）。两名患者的DP具有相似的组成，EX-U显示出预期的群体动态，即HSC群体收缩（Pt1比Pt4更明显），HSPC和Ery/Mk祖细胞扩增（Pt1更明显）。通过评估单细胞分辨率下LV特异性转录本（WPRE）的表达（图2I），我们能够估计随时间推移以及特定细胞簇内LV+转录组的百分比，作为转导效率的假定替代指标（图2K；表S3）。引人注目的是，我们在Pt4的EX-U过程中重现了WPRE+细胞的下降，而Pt1没有，这在HS（P）C中很明显，但在Ery/MK祖细胞中没有（图2L；表S3），这类似于患者骨髓中LV+ CFU相对于DP的下降（图2M）。这些数据突显了扩增培养物的scRNAseq在预先预测关键DP特征（如向长期HSC的基因转移）方面的潜力。
3.针对基因治疗应用的mPB CD34细胞扩增的迭代优化
为了进一步优化用于基因治疗应用的EX-U方案，我们采取了迭代方法。首先，根据培养的HSC中受体的表达（见图2G），我们询问是否可以用IL3替代IL6。在IL3存在下培养使扩增倍数增加了>3倍（n=3名志愿者mPB供体），同时降低了CD34+细胞的比例，但仍导致CD34+细胞绝对数量的净增加（图3A,B）。另一方面，IL6倾向于增加更原始的CD34+CD90+细胞的绝对数量（图3C），并且当与中等剂量的IL3联合使用时（条件G，SFT63组合）这种效应得以维持。线性混合效应模型显示，IL3和IL6对所有三个读数均有显著主效应（p<0.05），并且对于扩增倍数存在显著的IL3×IL6交互作用（p=0.005），反映了IL3的增殖效应占主导，以及在没有IL3的情况下IL6驱动的增殖效应更强（表S8）。异种移植证实了使用SFT63进行EX-U后植入改善的趋势，表明IL6和IL3的中等剂量组合是有益的（图3D）。
其次，我们在n=4名志愿者供体的mPB CD34+细胞上，在不同商品化培养基背景下测试了含有SFT63的EX-U方案。虽然扩增倍数相似，但培养基A（SCGM，CellGenix）在培养中最好地维持了具有原始免疫表型的细胞，这转化为与培养基B相比显著更高的植入（图3E,F）。然后，我们将我们的培养基A/SFT63条件与最近被提倡用于CB HSC扩增的化学成分限定（ChemD）培养基进行了基准测试。重要的是，ChemD无法扩增来自n=2名成人供体的mPB HSPC（图3G）。当向ChemD中添加IL3时，CD34+细胞的扩增得到部分挽救，证实了该细胞因子对mPB培养的重要性。
第三，我们在EX-U条件的基础上测试了其他已被证明可促进HSC扩增的小分子化合物的添加。用LVBC转导来自mPB的CD34+细胞，并在含有SFT63和UM171（EX-U）或UM171加SR1（一种芳烃受体拮抗剂）（EX-US）的培养基A中扩增（图3H）。异种移植显示，在血液（图3I）和骨髓（图3K）中，EX-US条件与EX-U相比，人CD45+细胞植入没有统计学显著差异，并且在克隆移植物多样性（图3L；表S4）或小鼠间条形码共享（图3M；表S4）方面也没有差异，表明EX-U和EX-US对培养中对称自我更新分裂的容许程度相似。然而，二次移植显示EX-US组在血液中植入显著更高（图3N），并且在骨髓植入方面有更高的趋势（图3O）。为了更好地理解二次再殖的动态，我们分析了原代和次级移植物之间共享克隆的丰度（图3P；表S5）。在EX-U和EX-US条件下，对次级小鼠造血有主要贡献的克隆在原代移植物中最初是次要克隆，反之亦然，证实了这些检测读取的是由具有不同潜伏期的长期HSC驱动的不同造血波次。因此，SR1虽然在使用优化培养条件时不是关键的，但可能在培养中为维持具有潜伏期特征的长期HSC提供额外益处。
第四，我们研究了在体外扩增方案中使用DEGS1抑制剂4HPR。与先前的报道一致，我们证实4HPR增加了CB HSC（CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+）的体外克隆形成能力，但不影响祖细胞（CD34+49f-）（图4A）。当补充4HPR时，无论是否添加UM171，在来自mPB的分选HSC中也发现了增强的CFU形成潜力（图4B），并且在LV转导后、铺于CFU培养基之前的7天体外扩增期间添加4HPR时也是如此（图4C）。受到这些表明4HPR对mPB HSC有特异性影响的数据的鼓舞，我们用UM171、SR1和4HPR的三联组合（EX-US4）扩增了另一名MPS患者（Pt5）的DP，并将植入与EX-US、EX-U或DP本身进行了比较（图4D）。与EX-U相比，EX-US4条件在12周时显示出显著降低的骨髓植入（图4E），但在二次再殖潜力方面与其他条件没有明显差异（图4F）。通过LVIS进行的克隆分析证实，在补充4HPR的培养中，独特的整合位点数量减少（图4G），原代移植物中的克隆大小分布没有重大变化（图4H）。对于Pt1和Pt2的异种移植物，在不存在SR1的情况下，向单独的UM171中添加4HPR（EX-U vs EX-U4）也未证实有任何益处（图S3C,D）。
为了了解LV转导是否在这一意外结果中起作用，我们对来自第8天扩增培养物的mPB CD34+CD38-细胞进行了有限稀释异种移植实验，使用EX-US或EX-US4条件，在模拟转导或LV转导后进行（图4I,K）。在模拟组中，当根据第0天当量剂量计算时，EX-US的HSC估计值为1/8,000，EX-US4为1/4,200（p=0.3，卡方检验）。然而，LV转导显著降低了EX-US和EX-US4条件下第0天当量的HSC频率，分别降至约1/18,000个细胞（p<0.03，卡方检验）（图S3E）。
综合起来，这些数据表明LV转导在体外扩增环境中累积地增加了应激反应，这可能导致HSC在异种移植实验中功能缺陷。因此，在mPB HSC基因治疗方案中，蛋白酶稳态抑制与慢病毒转导的组合不被认为是有益的。
4.控制剂量和转导时间窗可减轻体外扩增环境中的LV毒性
考虑到体外扩增培养对LV转导的意外敏感性，我们进一步研究了这一关键的基因工程步骤，以评估通过将LV暴露时间窗从标准的培养开始后24-48小时按24小时间隔移动，是否可以减轻LV诱导的毒性并更好地保留植入潜力（图5A）。在所有条件下，CD34表达的体外维持是一致的（图5B），而更长的预刺激增加了整体转导效率（图5C）。然而，当在72至96小时窗口（晚期转导组，EX-U3）进行转导时，EX-U细胞的植入潜力急剧下降，而如果在之前进行转导，则与DPlike细胞相等或略优（图5D）。组内条形码共享分析证实了体外对称HSC分裂，与EX-U2相比，晚期转导组中共享条形码有减少的趋势（图5E，表S6）。为了深入了解LV诱导的HSC效能损失的机制，我们对在早期（24小时）或晚期（72小时）时间点转导的体外扩增HSPC进行了bulk RNA测序。在体外扩增的72-96小时窗口期暴露于LV的CD34+ HSPC显示出衰老和衰老相关通路的强烈富集，这进一步证明LV转导在体外扩增背景下可能以剂量和时间依赖的方式产生有害影响（表S7，图5F）。基于这些发现，我们选择了一个从开始预刺激后36至48小时的中间转导时间窗（EX-U2）进行进一步测试。
我们将这种优化的转导/扩增方案（EX）与临床上验证的用于基因治疗的短程生产工艺（DPlike）进行了基准测试（图5G,H）。比较使用符合GMP标准的大规模工艺在透气袋中进行，并使用为治疗常染色体隐性遗传骨硬化症而开发的治疗相关纯化慢病毒载体，该设置适用于临床转化。将DPlike（每只小鼠2×10^5个细胞）的植入与EX的低剂量或高剂量进行比较，选择的剂量模拟临床上验证的人移植剂量（EXlow：每只小鼠4×10^6个细胞，EXhigh：每只小鼠28×10^6个细胞，对应第0天当量分别为每只小鼠1×10^5和7×10^5个细胞，或平均5×10^6-35×10^6个细胞/kg；每组n=14）。移植后8周血液中及19周骨髓中（图5I）的多谱系人细胞植入在高剂量EXhigh组中最高，而DPlike组介于高剂量和低剂量EXlow之间。考虑到整体移植物，这些数据与体外培养期间HSC净维持一致。然而，经基因工程改造的细胞（移植物中具有治疗意义的部分）在EX中的植入高于DPlike，即使在低剂量EXlow组中也是如此，如每个基因组的载体拷贝数（VCN）增加（图5J），归一化至VCN后独特整合位点的绝对数量增加（图5K）以及香农多样性指数增加（图5L）所示。这些结果突显了优化的扩增方案相对于当前标准方案的优势，即使在较低的移植细胞剂量下也是如此。
更多结果和补充图表：doi：10.1016/j.ymthe.2026.05.014
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