2区5.2分！胃印戒细胞癌中MUCL3+印戒细胞亚群的单细胞转录组图谱！scRNA-seq测序生信分析联合公共数据库挖掘证实MUCL3为特异性蛋白标志物

胃印戒细胞癌（GSRCC）是胃癌中极具侵袭性的亚型，以大量黏液分泌和高转移倾向为特征，但缺乏特异性生物标志物。本研究对3例GSRCC和2例胃腺癌（AC）患者的手术标本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），结合公共数据库（GSA-Human: HRA003647）独立队列验证，系统比较了两种亚型的细胞组成和分子特征。结果发现：GSRCC中黏液分泌上皮亚群（Mucous_muc5ac）显著扩增，其中MUCL3+亚群（Cluster 1） 在空间上与典型印戒细胞形态对应，首次在蛋白水平证实MUCL3为印戒细胞特异性标志物。多组学分析（inferCNV、CytoTRACE）显示，MUCL3+印戒细胞具有基因组不稳定性、去分化特征，并富集TNF-α/NF-κB、TGF-β/EMT、缺氧等通路，转移/血管生成基因评分升高。功能实验证实该亚群高表达的TFF1可促进胃癌细胞迁移。本研究为GSRCC的精准诊断和转移机制提供了新见解。

今天给大家解读一篇5月发表在《Cells》上的题目为“Single-Cell Transcriptomic Profiling Uncovers a Metastasis-Associated MUCL3+ Signet-Ring Cell Subpopulation in Gastric Cancer.”的文章。该研究利用单细胞RNA测序技术，对胃印戒细胞癌（GSRCC）和胃腺癌（AC）患者的肿瘤及癌旁组织进行分析。研究者发现GSRCC中Mucous_muc5ac粘液细胞亚群显著扩增，并从中鉴定出一个特异共表达MUCL3的印戒细胞亚群。他们验证了MUCL3作为印戒细胞蛋白标志物的潜力，并对该亚群的恶性分子特征（如基因组不稳定、激活转移相关通路）进行了解析，同时发现并验证了该亚群高表达的TFF1能够促进胃癌细胞迁移。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！

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团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
       
       
       

        
       
       
       

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CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

1. 发现与描绘
   对5例胃癌患者（3例GSRCC，2例AC）的10个配对组织样本进行scRNA-seq，鉴定主要细胞类型和上皮细胞亚群。
2. 聚焦关键亚群
   重点关注在GSRCC中显著扩增的Mucous_muc5ac粘液细胞亚群，分析其与AC相比的差异表达基因及富集通路。
3. 识别与验证新亚群
   对Mucous_muc5ac亚群进行再聚类，发现并鉴定出一个GSRCC特异性的MUCL3+亚群。通过独立公开数据集验证其转录谱，并在组织切片上利用多重免疫荧光（mIF）技术验证MUCL3、MUC5AC和TFF1在蛋白水平的共表达，证实其与印戒细胞形态的对应关系。
4. 分子与功能表征
   通过inferCNV、CytoTRACE、伪时间分析及通路富集分析，系统解析MUCL3+亚群的基因组不稳定性、分化状态及信号通路特征（如TNF-α/NF-κB、TGF-β/EMT、转移/血管生成相关）。
5. 功能验证
   关注该亚群中高表达的TFF1，通过qPCR验证其在GSRCC组织中的表达，并通过Transwell迁移实验验证TFF1促进胃癌细胞株迁移的功能。

研究亮点：

1. 蛋白水平验证了MUCL3的特异性
   首次通过多重免疫荧光在组织切片上证明，MUCL3蛋白在具有典型“印戒”形态的细胞中特异性高表达，确立了MUCL3作为GSRCC印戒细胞的候选蛋白标志物。
2. 揭示了MUCL3+细胞亚群的恶性特征
   通过整合多组学分析，不仅描述了该亚群的全基因组表达特征，还揭示了其伴随的基因组不稳定性、去分化状态以及促转移、促血管生成的分子特征。
3. 发现了TFF1作为候选效应分子的潜力
   在MUCL3+亚群中发现并验证了TFF1的显著上调，并通过体外实验证明TFF1能促进胃癌细胞迁移，为理解GSRCC的转移机制提供了新的方向。

研究结果：

1. 细胞图谱构建
   成功从10个组织样本中获得83,597个高质量细胞的单细胞图谱，鉴定出9种主要细胞类型和8个上皮细胞亚群。
2. Mucous_muc5ac亚群扩增
   在GSRCC中，粘液分泌性的Mucous_muc5ac亚群比例显著高于AC，且该亚群在GSRCC中表现出更高的拷贝数变异（CNV）和去分化状态。
3. MUCL3+印戒细胞亚群鉴定
   在Mucous_muc5ac亚群中发现了一个仅在GSRCC中显著富集的亚群（Cluster 1），其高表达MUCL3、MUC5AC和TFF1。多重免疫荧光证实，MUC5AC/MUCL3/TFF1三阳性的细胞呈现经典的印戒细胞形态，首次在蛋白水平证明了MUCL3是印戒细胞的特异性标志物。在MUCL3阳性样本中，约73%的印戒细胞为三阳性。
4. 恶性分子特征
   该MUCL3+亚群显示出高水平的基因组不稳定性（高CNV评分）和较低的CytoTRACE评分（提示更终末的分化状态）。通路分析显示其显著富集了TNF-α/NF-κB、TGF-β/EMT、KRAS、mTORC1等促癌通路以及“转移”和“血管生成”相关基因集。
5. TFF1的功能验证
   qPCR证实TFF1在GSRCC组织中表达显著高于AC和癌旁组织。Transwell实验表明，加入外源性TFF1蛋白能显著促进MGC803和MKN45胃癌细胞的迁移。

研究总结：

• 主要结论
  本研究揭示了胃印戒细胞癌中存在一个MUCL3+的印戒细胞亚群。MUCL3可作为该亚群的蛋白水平诊断标志物。该亚群具有高度恶性的分子特征，包括基因组不稳定、去分化、以及激活与转移、血管生成相关的信号通路。其高表达的TFF1可能是促进胃癌转移的候选效应分子。
• 讨论与意义
• 诊断价值
  MUCL3的表达模式在印戒细胞中具有高度特异性，相比其他广泛表达的标志物（如MUC5AC、TFF1），更具诊断潜力，为GSRCC的精确诊断提供了新靶点。
• 机制阐释
  研究提出了GSRCC恶性进展的一种潜在机制：肿瘤细胞劫持了正常胃小凹上皮细胞的分化程序（特别是粘液分泌途径），从而获得了侵袭性和转移能力。MUCL3+亚群的分子图谱为解释GSRCC的高转移倾向提供了细胞层面的依据。
• 局限性
  作者坦诚指出了研究的局限性，包括发现队列样本量相对有限；MUCL3与恶性特征的相关性尚不能推断因果关系；以及TFF1的功能验证是在常规胃癌细胞系而非真正的印戒细胞系中进行的，其具体作用机制仍需未来的体内外实验（如敲降/过表达、动物模型）进一步阐明。

结果译文：

通过对10份组织样本（5例胃癌患者）进行scRNA-seq分析，我们建立了一个包含83,597个高质量细胞的发现队列，并在独立队列（n=13）中验证了关键发现（图1A）。数据降维后，我们获得21个细胞簇（图1B）。基于既往文献报道和已知标志物对细胞类型进行注释，其中TRBC2、CD3E标记T细胞，CD79A、MS4A1标记B细胞，ACTA2、RGS5标记平滑肌细胞，SDC1、MZB1标记浆细胞，KRT18、EPCAM标记上皮细胞，CSF3R、FCGR3B标记中性粒细胞，KIT1、TPSAB2标记肥大细胞，CD68、CD163标记巨噬细胞，VWF、PECAM1标记内皮细胞，COL1A1、DCN标记成纤维细胞。点图分析证实了所鉴定的九种主要细胞类型的注释准确性（图1C）。t-SNE可视化展示了注释细胞类型的分布（图1D），而跨样本的细胞组成分析（图1E）显示患者间细胞分布均匀，表明批次校正成功。细胞比例的定量评估揭示了单个样本和组织来源之间的显著组成异质性（图1F、G）。根据组织来源的细胞组成显著异质性在独立验证队列中可重复，该队列显示出高度一致的细胞比例分布（补充图S2A-E）。这些跨队列一致的发现强调了组织微环境在塑造细胞谱系中的决定性作用，并为后续的生物学推断提供了统计学基础。

鉴于GSRCC独特的黏液丰富表型，本研究聚焦于上皮细胞。对所有样本的上皮细胞重新降维和聚类后（图2A），根据文献报道的特征基因鉴定了8个亚群（图2B、C）。癌症相关细胞由标志物CLDN4、CLDN7、REG4、KLK10、GPX2和KRT7定义；祖细胞由MKI67、H2AFZ和HMGB2定义；内分泌细胞由CHGA、CHGB和GAST定义；壁细胞由ATP4A、ATP4B和ESRRG定义；主细胞由PGA3和PGA4定义；肠上皮细胞由FABP1和APOA1定义。基于胃小凹黏液细胞标志物TFF1和MUC5AC的高表达，将亚群0定义为Mucous_muc5ac亚群。类似地，表达MUC6和TFF2的亚群2被指定为Mucous_muc6亚群。CNV分析显示，与主细胞、壁细胞和内分泌细胞相比，癌症相关细胞、祖细胞和肠上皮细胞的拷贝数变异增加，与先前研究一致。值得注意的是，黏液细胞（特别是Mucous_muc5ac亚群）显示出相对较高的拷贝数变异水平（图2D、E）。此外，在比较上皮亚群时，发现GSRCC中这些细胞的比例相对于AC显著增加（图2F）。这一模式在验证队列中一致地重现（补充图S3A-C）。

GSRCC在细胞形态、生物学行为、组织起源和分子表达谱方面与AC不同。为了系统鉴定GSRCC的特征性分子标志物，我们对GSRCC和AC的上皮组织进行了转录组差异分析，鉴定出GSRCC中显著上调的前35个基因（图3A）。这些基因在GSRCC中表现出高度特异且一致的上调模式（图3B）。其中，GAST、MUCL3、MUC5AC、TFF1、RASE6、LAMA3、GKN1、SQSTM1、SPATS2L、RAB11FIP1、LAMC2、PSD3、NEAT1、LAMB3、FER1L6、SULT2C2、LMO7、TFF2、PLAUR、GKN2、SYTL2、CAPN8、HDAC9、EPS8、CLDN18、TCF7L2和PHLDA2的一致上调在独立验证队列中得到确认（补充图S4A）。进一步分析显示，包括GAST、RASE6、LAMA3、SQSTM1、SPATS2L、LAMC2、PSD3、NEAT1、LAMB3、LMO7、SYTL2、HDAC9、TCF7L2和PHLDA2在内的基因不仅在GSRCC上皮组织中上调，而且与胃癌患者的不良预后呈显著正相关（补充图S4B），表明它们可能作为GSRCC的预后生物标志物。值得注意的是，在GSRCC上调的前35个DEGs中，参与胃黏液和消化酶功能的几个基因——包括MUCL3、MUC5AC、TFF1、TFF2、GKN1和GKN2——在Mucous_muc5ac亚群中显著且特异地富集（图3C、D）。重要的是，免疫荧光染色首次揭示了MUC5AC、TFF1和TFF2在印戒细胞中的高表达（图3E）。这一发现不仅验证了转录组结果，而且将这些分子的过表达精确定位到印戒细胞，首次提供了TFF1和TFF2在这些细胞中表达的蛋白水平证据，并对其潜在的细胞起源提供了见解。

基于先前对GSRCC和AC上皮细胞的系统分析，我们确定了Mucous_muc5ac亚群在GSRCC中的独特生物学作用。该亚群的显著富集与GSRCC特征性的黏液分泌表型密切相关，表明其在肿瘤发生和进展中的潜在关键作用。使用inferCNV对Mucous_muc5ac亚群的表征显示，其GSRCC来源的子集中存在显著的CNV积累（图4A、B）。通过CytoTRACE算法对分化潜能的进一步评估显示，GSRCC的Mucous_muc5ac亚群具有强去分化特征（图4C、D）。分子谱分析显示，与AC相比，SRCC上皮细胞中Mucous_muc5ac亚群的转录组发生了显著重塑（图4E）。在该亚群上调的前20个DEGs中，黏液相关因子（如MUCL3、MUC5AC）和其他基因（如GAST、CEACAM5、NEAT1）均与患者不良预后特异性相关（补充图S4B和S5A），进一步强调了这些分子标志物的临床相关性。通路分析（图4F、G）显示，GSRCC中上调的DEGs富集于TNF-α/NF-κB信号、PI3K-Akt通路和黏液型黏液产生（KEGG/HALLMARK，adj. p<0.05）。TNF-α、NF-κB和TGF-β通路的一致富集与已确定的印戒细胞功能一致，证实了它们在GSRCC中的关键作用。

为了描绘Mucous_muc5ac亚群内的细胞异质性，我们对全基因组表达谱进行了无监督聚类，鉴定出五个不同的亚簇（簇0-4；图5A）。其中，簇1在GSRCC组织样本中独特且显著富集（图5B）。Mucous_muc5ac每个亚簇中按患者划分的细胞数量细目见补充表S1。分子表征显示，该亚簇由黏蛋白基因MUCL3的高且特异性表达定义（图5C），同时伴随已确立的印戒细胞标志物MUC5AC和TFF1的协调上调（图5D）。这些发现在独立队列中得到验证，该队列证实了与AC相比，GSRCC中MUCL3和黏液-消化酶基因的表达升高（补充图S6A、B）。此外，对Mucous_muc5ac亚群的重新聚类表明，高MUCL3表达选择性地存在于GSRCC相关细胞中（补充图S6C-E）。基于其独特的空间富集和分子特征，我们假设该亚簇代表具有GSRCC诊断相关性的特征性印戒细胞群体。为了验证这一点，我们在GSRCC和非GSRCC组织切片上进行了多重免疫荧光。引人注目的是，MUC5AC、MUCL3和TFF1三重阳性的细胞表现出典型的印戒形态（图5E），从而首次提供了印戒细胞中MUCL3特异性过表达的蛋白水平证据。MUCL3在印戒细胞中的表达在GSRCC样本中呈异质性，部分病例显示三重阳性细胞，而其他病例仅显示MUC5AC+/TFF1+而无MUCL3，证实MUCL3标记了一个特定的亚群。在MUCL3阳性病例中，约73%的印戒细胞为三重阳性（中位数73.0%，范围70.8-77.8%），表明在阳性样本中，MUCL3标记了胃型印戒细胞的一个主要但非普遍的亚群。

综合多组学分析显示，MUCL3+印戒细胞亚群在GSRCC中表现出高度恶性的分子特征。该亚群表现出显著的基因组不稳定性，伴有明显的CNV积累（图6A、B），以及更终末分化的状态，如较低的CytoTRACE评分所示（图6C-E）。这些特征在独立队列中得到了一致验证，其中MUCL3高表达的细胞同样显示出较低的CytoTRACE评分和升高的CNV（补充图S7A-D）。为了进一步验证这一分化轨迹，我们进行了伪时间分析，将MUCL3+簇1置于末端（补充图S8）。Hallmark通路分析显示，该亚群中促肿瘤发生过程广泛激活，包括炎症反应（TNFA/NFKB、IL2-STAT5、干扰素-γ）、促增殖信号（KRAS、mTORC1）、代谢重编程以及驱动侵袭的关键过程（上皮-间质转化、TGF-β信号）（图6F）。在验证队列中使用MUCL3高表达与MUCL3低表达细胞进行的Hallmark富集分析确认了EMT、炎症反应和KRAS信号通路的一致富集（补充图S9）。一致地，基因集变异分析显示转移和血管生成相关评分升高（图6G），提示与腹膜播散相关的侵袭性和促血管生成能力的潜在关联。在该亚群中，我们进一步研究了共同上调的基因TFF1。验证队列中的单细胞相关分析显示，TFF1表达与MUCL3呈正相关，并在MUCL3+ GSRCC细胞中显著富集（补充图S10）。qPCR证实，与癌旁组织和AC组织相比，TFF1在GSRCC组织中上调（图6H）。在胃癌细胞系（MGC803、MKN45）中的功能验证表明，重组TFF1（2 μg/mL，24小时）与Transwell实验中迁移增加相关（图6I、J）。这些发现表明TFF1可能作为候选效应因子，促成与MUCL3+分子特征相关的侵袭性表型。

更多结果和补充图表：doi：10.3390/cells15100857

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