CHCHD10基因突变与ALS-FTD及线粒体心肌病相关。本研究利用Chchd10 S55L/+基因敲入小鼠模型，结合蛋白质组学、转录组学及磷酸化蛋白质组学，首次揭示突变导致CHCHD10蛋白不溶性增加，引发线粒体膜间隙蛋白稳态失衡，特别是细胞色素c生物合成缺陷，导致早期呼吸链受损。同时激活OMA1-DELE1-HRI介导的线粒体整合应激反应。抑制mtISR虽可短暂改善心功能，但无法逆转CHCHD10不溶性及OXPHOS缺陷。外源性细胞色素c可恢复突变线粒体呼吸，提示靶向细胞色素c途径为潜在治疗策略。本研究为理解CHCHD10相关心肌病机制提供了全新视角。
今天给大家解读一篇2月发表在《EMBO Molecular Medicine》上的题目为“Mutant CHCHD10 disrupts cytochrome c oxidation and activates mitochondrial retrograde signaling.”的文章。本研究旨在阐明CHCHD10 S59L突变导致线粒体疾病（特别是心肌病）的分子机制。通过系统表征Chchd10S55L/+小鼠模型，作者发现突变CHCHD10蛋白聚集是疾病发生的始动因素。这种聚集同时引发了两个早期、并行的病理过程：一是通过破坏线粒体膜间隙（IMS）的蛋白质稳态，损害细胞色素c的生物合成和铜稳态，直接导致细胞色素c氧化和呼吸功能缺陷；二是激活了OMA1-DELE1-HRI通路的线粒体综合应激反应（mtISR）。遗传学抑制OMA1活性可钝化mtISR并延缓心肌病发生，但无法纠正CHCHD10不溶性、嵴结构缺陷、细胞色素c氧化障碍及mtDNA减少等根本问题。蛋白质组学分析进一步揭示了IMS蛋白质稳态的广泛破坏。最终，外源性细胞色素c补充成功挽救了突导线粒体的呼吸缺陷，从而精准定位了IMS蛋白质稳态和细胞色素c生物学是突变CHCHD10致病的关键环节和潜在治疗窗口。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！
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题目：《突变的CHCHD10破坏细胞色素c的氧化并激活线粒体逆行信号传导》Mutant CHCHD10 disrupts cytochrome c oxidation and activates mitochondrial retrograde signaling
发表期刊：EMBO Molecular Medicine
影响因子：8.3
研究背景：
CHCHD10是线粒体膜间隙（IMS）蛋白，其突变可导致肌萎缩侧索硬化-额颞叶痴呆（ALS-FTD）、心肌病等多种线粒体疾病。与ALS-FTD相关的S59L显性突变（小鼠中为S55L）会导致CHCHD10蛋白在IMS内聚集和不溶解，并伴随线粒体嵴结构异常、mtISR激活等。然而，关于是生物能量衰竭还是适应不良的应激信号驱动病理发生，以及CHCHD10不溶性、mtISR与呼吸链缺陷之间的关系，仍存在争议。先前在不同CHCHD10突变模型或不同组织中操纵OMA1（mtISR的关键激活因子）得出了相互矛盾的结果，使得mtISR的功能影响扑朔迷离。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 表型确认与早期事件界定
在C57BL/6N背景的Chchd10S55L/+小鼠中，通过超声心动图纵向评估心脏功能，并结合生化方法检测CHCHD10不溶性和mtISR激活的时间点，确认它们在心肌病发作前就已出现。
- 解耦mtISR与表型
通过CRISPR/Cas9构建蛋白酶催化失活的Oma1E324Q/E324Q小鼠，并将其与Chchd10S55L/+小鼠杂交，获得双突变体。以此评估在抑制mtISR信号（通过转录组学和蛋白质组学验证）后，心脏功能、CHCHD10不溶性、线粒体呼吸、嵴结构、mtDNA含量等核心表型是否得到挽救。
- 探究生物能量缺陷根源
对患病早期小鼠的心脏线粒体进行高分辨率呼吸测量，发现呼吸缺陷；随后通过线粒体蛋白质组学、差异溶解度蛋白质组学、BN-PAGE、金属组学（ICP-OES）等方法，系统筛查线粒体蛋白质组、复合物组装、金属稳态的变化，定位关键缺陷环节。
- 功能验证与治疗靶点探索
基于蛋白质组学发现的细胞色素c相关缺陷，在体外呼吸测量实验中直接测试外源性补充细胞色素c能否挽救突导线粒体/线粒体质体的呼吸功能。
研究亮点：
- 因果关系厘清
证明了突变CHCHD10的不溶性是致病的主要触发因素，同时导致生物能量缺陷和应激信号激活，两者可被解耦。
- 关键治疗漏洞
发现外源性补充细胞色素c可以直接挽救突导线粒体的呼吸缺陷，为治疗提供了清晰的靶点。
- 机制创新
揭示了CHCHD10不溶性通过破坏MIA40/ERV1介导的IMS蛋白质稳态，特别是影响细胞色素c的生物合成，从而导致呼吸链功能早期障碍。
- 争议解答
通过使用蛋白酶失活的Oma1E324Q/E324Q小鼠，证明抑制mtISR可延缓心肌病但不挽救根本的线粒体缺陷，表明生物能量衰竭是独立于mtISR的早期致病事件。
研究结果：
- 心脏表型与早期事件
Chchd10S55L/+小鼠出现早发型心肌病，寿命缩短。CHCHD10蛋白聚集、不溶性以及mtISR的激活均发生在心脏功能障碍出现之前（14周龄），且存在性别差异（雄性更早出现功能异常）。
- 早期生物能量缺陷
在症状出现期（14周龄），突变小鼠心脏线粒体利用碳水化合物和脂肪酸的氧耗率均下降，且与线粒体膜电位无关。这种呼吸缺陷在CHCHD10可溶性正常的肝脏线粒体中未出现。
- 蛋白质组与细胞色素c氧化缺陷
心脏线粒体蛋白质组发生广泛重塑，涉及OXPHOS复合物（特别是复合物IV）、MICOS复合物、铜代谢相关蛋白的下调。BN-PAGE显示复合物IV组装减少。呼吸测量证实细胞色素c氧化能力降低约40%。ICP-OES显示心脏及线粒体内铜含量降低，但铁、血红素含量正常。
- 抑制OMA1/mtISR的效果
Oma1E324Q/E324Q Chchd10S55L/+双突变小鼠的mtISR被显著抑制。然而，CHCHD10不溶性、线粒体呼吸缺陷、细胞色素c氧化障碍、嵴结构异常和mtDNA减少均未被挽救。尽管如此，双突变小鼠的心脏功能在早期（16周）得到改善，但这种保护作用是暂时的，到35周时功能再次恶化。
- IMS蛋白质稳态与细胞色素c缺陷的核心作用
差异溶解度蛋白质组学显示，突变线粒体中包括细胞色素c在内的多种IMS蛋白不溶性增加。免疫印迹证实细胞色素c蛋白水平在症状前期就已显著降低。最关键的是，在体外实验中，向突导线粒体质体补充外源性牛细胞色素c，可立即将其受损的呼吸速率恢复至与野生型相当的水平。
- 次要发现
Sting基因缺失可暂时改善Chchd10突变小鼠的心脏功能，提示天然免疫信号也参与了疾病进程的调节。
研究总结：
1.致病机制的双重性
突变体通过破坏IMS蛋白质稳态（尤其是依赖MIA40/ERV1通路输入的蛋白如细胞色素c），直接导致早期生物能量缺陷；同时独立地激活了适应不良的mtISR信号。两者共同推动心肌病发展。
细胞色素c生物合成和功能的缺陷被确定为关键的“治疗漏洞”，因为其可被外源性补充所逆转。这为开发针对线粒体心肌病的疗法提供了新方向。
研究证实，在Chchd10S55L/+心肌病模型中，呼吸链缺陷是早期事件而非mtISR的晚期后果。抑制mtISR（通过失活OMA1）虽能延缓表型，但治标不治本，无法逆转由蛋白质聚集引发的根本性生物能量危机。
作者讨论了本研究与之前基于不同小鼠亚系（C57BL/6J）研究结果存在差异的可能原因（遗传背景、性别、环境）。同时指出，OMA1抑制的保护作用可能是组织特异性的，因为在骨骼肌的CHCHD10G58R模型中OMA1缺失是有害的。未来需要探索在神经肌肉系统中是否也存在类似的细胞色素c缺陷机制，并评估靶向此通路在更广泛线粒体疾病中的治疗潜力。
结果译文：
1.CHCHD10不溶性在Chchd10小鼠中触发ISR激活和心脏重塑
导致人类多系统线粒体功能障碍的CHCHD10显性致病性S59L变异体（Bannwarth等，2014）促进了CHCHD10蛋白的不溶性，并损害了杂合Chchd10<sup>S55L/+</sup>基因敲入小鼠（以下简称Chchd10小鼠）的心脏功能，导致其在1岁时发生心力衰竭和死亡（图1A）（Genin等，2019；Anderson等，2019）。我们在重新衍生并维持在C57Bl6/N背景上的Chchd10突变小鼠中证实了这些发现，并通过纵向超声心动图表征了其心脏功能（图1B,C和EV1A,B）。虽然突变小鼠的寿命在雄性和雌性中缩短程度相似（图EV1C），但我们在14周龄时观察到心脏功能障碍的性别差异：仅雄性突变小鼠表现出左心室射血分数降低（图1B,C）。与此一致，心脏功能障碍生物标志物NPPA在雄性Chchd10小鼠中上调5.6倍，而在雌性中仅上调4倍（图1D），表明心脏功能障碍的发作受生物学性别的影响。另一方面，在雄性和雌性Chchd10突变小鼠的心脏裂解物中，CHCHD10蛋白积累增加的程度相似（图1E），对分离的心脏线粒体进行的碱性碳酸钠提取研究表明，在pH 9.5和pH 11.5条件下，突变小鼠的CHCHD10溶解度均降低（图1F）。Chchd10突变心脏线粒体中不溶性沉淀部分中CHCHD10丰度的增加并不反映蛋白质不溶性的普遍破坏，因为其他线粒体标志物如MT-CO2、ANT1和HSP60在基因型之间的行为相似（图1F；附录图S1）。CHCHD10不溶性在雄性和雌性小鼠的心肌病发作之前出现（图1D,F），并且与ISR的诱导相关，这可以通过心脏bulk RNAseq（图1G；数据集EV1）以及标志基因Atf4、Atf5、Trib3、Mthfd2、Phdgh、Asns、Aldh18a1和Fgf21的qRT-PCR分析来测量（图EV1E）。差异表达基因的转录组学分析显示，与性别匹配的野生型对照相比，雄性和雌性Chchd10突变小鼠的核心ISR基因表达特征的诱导相似（Labbé等，2024）（图1G和EV1E）。总之，我们的数据支持这样的模型（Sayles等，2022），即导致CHCHD10不溶性和ISR诱导的最早缺陷触发了心脏功能障碍的发作。
尽管转录组学分析显示雄性和雌性突变心脏中ISR诱导的幅度和时机相似（图1G；数据集EV2），但我们观察到了性别特异性差异基因表达，这提示线粒体功能障碍下游的细胞信号传导可能调节心肌病的进程。Chchd10突变心脏中157个雌性特异性上调的DEG与涉及BMP10（Qu等，2019）和NR4A3（Jiang等，2019）的心脏保护通路相关，这些通路的独立上调已被证明可预防心肌病。在雄性突变小鼠中，基于356个上调的雄性特异性DEG的通路富集分析揭示了免疫、炎症和趋化因子信号传导的诱导，这些信号是宿主-病原体相互作用通路（包括病毒、细菌和寄生虫）的特征（图1H；数据集EV2）。当将有症状的Chchd10雄性小鼠的所有955个上调DEG与其野生型同窝雄性小鼠进行比较时，这些富集的通路也出现了，但在雌性中未观察到同样情况（图EV1F,G，数据集EV3和4）。下调的通路包括与mtDNA转录相关的通路，在雄性和雌性Chchd10小鼠中同样富集，这与我们在心肌病发作时观察到的mtDNA相对减少一致（Genin等，2019）（图EV1H）。由于Chchd10突变小鼠饲养在特定无病原体和机会性病原体条件下，我们想知道响应线粒体功能障碍而触发的过度活跃的先天免疫信号传导是否可能导致心脏炎症和功能障碍，正如其他MD模型中所见（Lei等，2021；Oka等，2012）。为了验证这一假设，我们通过将Chchd10小鼠与Goldenticket小鼠（Sting<sup>G/G</sup>，图EV1I）杂交，在Chchd10突变小鼠中通过全身消融干扰素基因刺激因子来减弱先天免疫信号传导，Goldenticket小鼠携带Sting的功能丧失性I199N突变，有效地敲除了该基因（Sauer等，2011）。Sting编码一种跨膜ER蛋白，作为参与干扰素信号传导的衔接蛋白，可被微生物感染和线粒体功能障碍触发以激活先天免疫（Lei等，2023）。对Chchd10<sup>S55L/+</sup>Sting<sup>Gt/Gt</sup>（以下简称Chchd10/Sting）突变小鼠的回声分析显示，在38周龄时心脏功能得到恢复，但在48周龄时左心室射血分数受损（图EV1J），表明抑制线粒体功能障碍下游的过度活跃的先天免疫信号具有暂时的心脏保护作用。Sting缺失对Sting<sup>Gt/Gt</sup>（以下简称Sting）小鼠的心脏功能没有负面影响（图EV1J），也不影响Chchd10/Sting小鼠的体重减轻或寿命缩短（图EV1K,L）。总之，我们的数据表明，由线粒体功能障碍触发的炎症信号可以调节由突变CHCHD10不溶性引起的心脏功能障碍的进程。
2.线粒体呼吸受损是突变Chchd10心脏的早期缺陷
突变CHCHD10触发ISR诱导，随后导致依赖于铁和铁硫簇的代谢的代谢重编程。由于在晚期的Chchd10小鼠中观察到OXPHOS功能障碍，这导致了一种观点，即线粒体呼吸受损是心肌病的结果而非原因（Sayles等，2022）。当我们从14周龄开始的Chchd10突变小鼠中分离的心脏线粒体通过高分辨率呼吸测量法测量耗氧率时，我们观察到在碳水化合物和脂肪酸衍生底物上的耗氧缺陷（图2A,B），这在（有症状的）雄性和（症状前的）雌性突变小鼠中同等程度地减少。这些缺陷并未伴随线粒体膜电位的丧失，这与线粒体解偶联的说法相悖（图2C,D）。我们观察到来自Chchd10小鼠肝脏的线粒体呼吸正常，而CHCHD10在肝脏中的溶解度不受影响（图2E,F），这进一步强化了CHCHD10不溶性与生物能量功能障碍之间的关联。从7周龄无症状的雄性Chchd10小鼠中分离的心脏线粒体的线粒体呼吸和膜电位未受影响（图EV2A-C）。这些数据表明，线粒体的生物能量损伤是与CHCHD10不溶性相关的早期功能障碍，它可以在心脏功能障碍之前发生或同时显现。
为了理解突变CHCHD10导致线粒体呼吸降低的原因，我们比较了从WT和Chchd10小鼠分离的心脏线粒体的蛋白质组，这揭示了一个剧烈的重塑：在MitoCarta 3.0中鉴定的940个定量线粒体蛋白质中，71%是差异表达的，其中大部分下调（平均log2FC = -0.7（图2G）。根据已知的亚线粒体定位（OMM、IMS、IMM或基质）对MitoCarta 3.0 DEP进行分层，未揭示亚线粒体区室的偏向性，强调了线粒体蛋白质稳态的普遍失调（图EV2D）。一维富集分析揭示了几个MitoPathways，特别是那些参与OXPHOS和MICOS复合物维持和组装以及铜代谢的通路（图2H-K和EV2E）。对定量MitoCarta 3.0蛋白质的绘图显示，复合物IV组分（图2I）以及其他OXPHOS复合物（图EV2E）的稳态水平显著降低。BN-PAGE分析显示，复合物I、II、III和V的水平正常，而复合物IV组装体特异性减少（图2L和EV2F），这伴随着其亚基和组装因子如COA8、COX16、COX18、COX20、COX4L1、COX5A、COX6B1、COX6C、COX7A1、COX7A2L、COX7B、COX7C、COX8B、COX10、COX15、COX18、COX20以及mtDNA编码的蛋白MT-CO1、MT-CO2和MT-CO3的水平降低。我们观察到HIGD1A减少（图2I），它协调含COX复合物的组装（Timón-Gómez等，2020），并且COX6A1和COX6A2同种型之间的平衡发生改变，据报道这会影响含COX超级复合物的稳定性（Cogliati等，2016）。在存在抗霉素A、TMPD、抗坏血酸和CCCP的情况下，对分离的心脏线粒体进行的高分辨率荧光呼吸测量法（通常用于测量复合物IV活性）（Villani和Attardi，1997）显示，在14周龄的（有症状）雄性和（症状前）雌性小鼠中，耗氧率均下降约40%（图2O），指向细胞色素c氧化缺陷。我们观察到铜处理蛋白COX11、COX19、SCO1、CHCHD7和IMM铜转运蛋白SLC25A3减少（图2J），所有这些都是COX金属化所必需的（Cobine等，2021）。此外，通过SCO1提供组装COX1和COX2模块所需的Cu以组装全酶COX的COX17也减少了。在酵母中，COX17参与COX的组装以及MICOS复合物的组装（Chojnacka等，2015），MICOS是一个连接外膜和内膜的完整膜复合物，对维持嵴结构至关重要（Anand等，2021）。分离的心脏线粒体的蛋白质组学分析还显示，MICOS亚基MIC60/IMMT、MIC13、CHCHD3、APOO和APOOL以及MICOS相互作用因子OPA1减少（图2K），OPA1在维持嵴结构中也起核心作用（Frezza等，2006）。与此一致，MICOS复合物的BN-PAGE分析显示，在14周龄（但非7周龄）时，MIC60免疫反应性降低（图2M），这与先前在CHCHD10患者来源的成纤维细胞中报道的破坏平行（Genin等，2022）。
铜是几种线粒体酶的必需氧化还原辅因子，包括细胞色素c氧化酶（复合物IV），其CuA和CuB位点的金属化对于组装和酶活性至关重要（Cobine等，2021）。由于破坏铜插入复合物IV的遗传缺陷会导致小鼠和人类出现严重的多系统缺陷，包括心力衰竭（Papadopoulou等，1999；Stroud等，2015；Valnot等，2000b；Leary等，2007；Baker等，2017；Boulet等，2018），我们通过电感耦合等离子体发射光谱法测量了Chchd10突变心脏中的铜水平，该方法能够直接、精确、灵敏和准确地测量生物学中的金属（Cubadda，2007）。ICP-OES分析揭示了14周龄突变雄性和雌性小鼠的心脏和线粒体（图2N）铜含量减少，这与观察到的细胞色素c氧化速率降低一致（图2O）。与先前的研究（Sayles等，2022）相反，在7周龄或14周龄时均未观察到铁或血红素的减少（图EV2G,H）。我们观察到在14周龄的Chchd10突变雄性和雌性小鼠中，总心脏（而非线粒体）铁水平增加了约1.3倍（雄性1.31倍，雌性1.29倍）。ICP-OES显示其他金属如锌、镁或锰在Chchd10心脏和心脏线粒体中未改变（图EV2I）。总之，我们的数据揭示，CHCHD10蛋白溶解度缺陷与细胞色素c氧化受损相关，这可能促成Chchd10突变小鼠的病理性心脏重塑。
3.抑制OMA1催化活性可抑制mtISR，但不能抑制CHCHD10不溶性
先前对Chchd10小鼠的研究暗示，mtISR的诱导通过线粒体代谢的适应不良性重编程导致了OXPHOS功能障碍（Sayles等，2022；Southwell等，2024；Anderson等，2019）。CHCHD10<sup>S59L</sup>触发应激诱导的金属蛋白酶OMA1的激活，OMA1在IMS中蛋白水解加工DELE1，使切割后的形式能够被输出到细胞质，在那里它通过血红素调节抑制剂激酶进行信号传导以激活ISR（Shammas等，2022；Guo等，2020；Fessler等，2020；Sekine等，2023；Fessler等，2022）。监测另一个经典OMA1底物L-OPA1的蛋白水解切割，揭示出在有症状的Chchd10突变小鼠（14周龄）中OMA1被激活，而在症状前心脏（7周龄）中有限，后者显示MTHFD2、SQSTM1/P62和LC3-II水平升高（图EV3A），表明应激诱导的OPA1加工发生在ISR诱导之后。由于在心肌细胞特异性Yme1l1敲除小鼠的心脏中，OMA1消融可以抑制心脏功能障碍和线粒体碎片化（Wai等，2015），并且根据在35周龄进行的bulk RNAseq研究，这些小鼠也显示OMA1活性增加和ISR信号传导（图EV3B），我们想知道OMA1失活是否能对Chchd10突变小鼠提供心脏保护。在携带G58R变体的Chchd10突变小鼠中，全身性Oma1缺失是合成致死的（Shammas等，2022），这促使我们通过Crispr/Cas9基因组编辑在C57Bl/6 N小鼠中生成催化位点突变体E324Q（图3A,B），已知该突变可抑制OMA1的蛋白水解活性，而不会破坏其在IMM中假定的、非催化的支架功能（Wai等，2016；Baker等，2014）。Oma1<sup>E324Q/E324Q</sup>（以下简称Oma1）突变小鼠外表正常，在14周龄进行的心脏转录组学分析显示几乎没有基因失调：在17,1911个基因中，Oma1雄性和雌性小鼠分别有6个和3个差异表达基因（图EV3C；数据集EV1）。类似地，从WT和Oma1雄性小鼠分离的心脏线粒体的蛋白质组学比较未发现差异表达蛋白（图EV3D；数据集EV5），这与先前对心肌细胞特异性Oma1敲除小鼠的蛋白质组学分析一致（Ahola等，2022）。我们通过检查来自Oma1胚胎的小鼠成纤维细胞中组成型和CCCP诱导的OPA1加工（图EV3E）以及心脏线粒体（图EV3F），确认了OMA1的催化失活。接下来，我们将Oma1和Chchd10突变小鼠进行杂交，并成功以孟德尔比率生成了Oma1<sup>E324Q/E324Q</sup>Chchd10<sup>S55L/+</sup>（Chchd10/Oma1）双突变小鼠（图3B）。双突变雄性和雌性小鼠外表正常，通过RT-qPCR和bulk RNAseq分析显示心脏ISR诱导显著减少（图3C和EV3G,H；数据集EV1,6），并且OMA1依赖性L-OPA1加工减少（图EV3F），进一步验证了这些小鼠中OMA1活性和mtISR的抑制。类似地，雄性小鼠的蛋白质组学分析显示，与从Chchd10小鼠分离的心脏线粒体相比，Chchd10/Oma1心脏线粒体中ISR蛋白水平降低（图3D）。在Chchd10/Oma1心脏中（相对于Chchd10）被抑制的大部分上调DEP是DELE1依赖性mtISR因子（Lin等，2024；Labbé等，2024），包括PYCR1、AKR1B7、MTHFD2、PCK2、MTHFD1L、ALDH18A1、GHITM、GPT2、LONP1、GARS1、GATM和SHMT2（图EV3I）。然而，mtISR信号传导的抑制与突变CHCHD10的溶解度恢复无关：Na2CO3提取研究表明，与WT和Oma1心脏线粒体相比，Chchd10和Chchd10/Oma1中CHCHD10同样不溶（图3E；附录图S2），证明CHCHD10不溶性可以与mtISR诱导解偶联。
4.抑制OMA1延迟Chchd10突变小鼠的心肌病
在生成了具有失活OMA1和减弱mtISR的可行Chchd10突变小鼠后，我们决定探究OMA1失活是否调节Chchd10/Oma1心脏中的线粒体功能障碍。高分辨率呼吸测量法显示，与WT和Oma1同窝小鼠相比，雄性Chchd10/Oma1和Chchd10心脏线粒体的细胞色素c氧化速率同等程度地降低（图3F）。与此一致，线粒体蛋白质组学的主成分分析显示，Chchd10和双突变小鼠有相当大的重叠，表明这两组的线粒体蛋白质组相似，它们与WT和Oma1心脏蛋白质组明显区分开来（图EV3J）。这些数据表明，在Chchd10小鼠心肌病发作时观察到的生物能量缺陷并非由mtISR激活引起，这与先前在表达不溶性突变CHCHD10<sup>G58R</sup>的HEK293T细胞中的体外观察结果一致，其中OMA1沉默并未挽救线粒体呼吸（Shammas等，2022）。对线粒体大小和嵴含量的TEM分析显示，尽管应激诱导的OPA1加工受到抑制，但Chchd10/Oma1心脏中突变Chchd10心脏的缺陷（图3G,H）并未得到挽救。我们通过qPCR在14周龄的雄性和雌性Chchd10突变心脏中观察到mtDNA减少36%（图3I），这反映了mtDNA因子如TFAM（其丰度追踪并控制mtDNA含量的mtDNA类核调节因子）（Jiang等，2017；Kaufman等，2007；Larsson等，1998）以及POLG2、POLRMT、TWINKLE和mtSSB的减少（图3J）。这些mtDNA缺陷在14周龄的Chchd10/Oma1小鼠中也未得到挽救（图3I,J），这与mtISR在心脏功能障碍发作时调节mtDNA含量的观点相悖（Sayles等，2022）。尽管Chchd10/Oma1小鼠心脏中线粒体的结构和功能缺陷持续存在，但超声心动图显示双突变小鼠的心脏功能有所改善（图3K,L）：在16周龄的雄性突变小鼠中，降低的左心室射血分数恢复到与野生型小鼠无差异的水平（图3L），表明OMA1失活具有心脏保护作用。OMA1失活并未挽救由突变CHCHD10诱导的心脏纤维化（图EV3K），并且到35周龄时，双突变小鼠的心脏功能下降到与Chchd10突变小鼠相当的水平，表明OMA1依赖性心脏保护是暂时的（图3K,L）。值得注意的是，雄性和雌性双突变小鼠的寿命和体重增长曲线与Chchd10突变小鼠相似，这表明OMA1抑制影响器官功能的分子机制可能是组织特异性的（Lin等，2024；Shammas等，2022）（图EV3L,M）。总之，我们的数据表明，OMA1失活独立于对突变Chchd10小鼠中细胞色素c氧化、mtDNA含量和嵴结构缺陷的调节，延迟了心肌病的发作。
为了深入了解OMA1失活如何调节下游心脏信号传导，我们通过bulk RNAseq分析了心脏转录组。首先，我们决定比较雌性Chchd10/Oma1与雌性Chchd10小鼠，因为两者在14周龄时心脏功能正常，使我们能够识别响应突变CHCHD10可被调节的OMA1特异性通路。与ISR信号传导减少一致，我们在Chchd10/Oma1双突变心脏中观察到67个DEG中有31个参与ATF依赖性信号传导（图EV3N；数据集EV1），这与显示ISR标志物减少的qRT-PCR研究一致（图3C）。因此，对Chchd10心脏中相对于Chchd10/Oma1心脏上调的31个DEG的Enrichr通路分析揭示了氨基酸代谢（甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸）、铁死亡以及叶酸和一碳代谢的参与（图EV3N；数据集EV6），以及与PERK、GCN2、ATF和HRI信号传导相关的应激信号通路。另一方面，有55个基因在Chchd10/Oma1心脏中相对于Chchd10心脏上调，其中包括参与抗病毒和干扰素信号通路的因子，如Cxcl9、Cxcl10、Cxcl12和Cxcl21a，以及Irf7、Isg15、Oasl1、Irgm1和Mx2。仔细观察揭示了一个特异但有限的属于这些簇的上调基因集，其中包括IFIT家族成员（Ifit1、Ifit2、Ifit3和Ifit3b），它们先前已被鉴定为病原体诱导的NF-kappaB和TNF信号传导的负调节因子（Li等，2009；John等，2018；Kimura等，2019）。对22周龄心脏进行的天狼星红组织学分析显示，Chchd10/Oma1和Chchd10小鼠（两性）均出现心脏纤维化。雄性和雌性Chchd10小鼠心脏纤维化的程度未显示性别二态性，这表明雌性心脏可能比雄性心脏更能应对线粒体功能障碍（图EV3K-M）。实际上，对14周龄WT雄性和雌性同窝小鼠DEG的比较揭示，雄性特异性上调了炎症因子C7和Ccl11，以及Nppb（数据集EV1），后者编码与心输出量减少和心脏损伤增加相关的B型钠尿肽（Goetze等，2020），这与雄性小鼠对心肌病的既定潜在敏感性一致（Lindsey等，2024）。总之，我们的数据表明，OMA1失活通过与抑制mtISR相关的转录重塑赋予心脏保护作用。
5.CHCHD10不溶性破坏IMS和IMM蛋白质稳态
在鉴定了Chchd10突变小鼠心脏中线粒体功能障碍触发的下游信号通路后，我们将注意力重新集中在细胞色素c氧化缺陷的分子基础上。起初，最直接的解释是复合物IV的酶缺陷，这与铜和复合物IV超级复合物水平降低相关（图2L）。然而，通过高分辨率呼吸测量法测量的细胞色素c氧化速率降低约50%，与雄性和雌性线粒体铜含量分别减少31%和21%相关（图2N）。同样，最近的研究对在基础条件下受损的呼吸链超级复合物组装与心脏稳态的功能相关性提出了质疑（Milenkovic等，2023）。心脏线粒体蛋白质组学显示，与复合物IV相关的大多数DEP减少（图2G,I），然而，Chchd10和WT心脏的成对比较揭示，COA4和COA7的水平意外增加，两者都是双Cx(9)C基序IMS蛋白，通过处理线粒体铜而与复合物IV功能相关（Swaminathan等，2022；Formosa等，2022）（图2I）。由于这些蛋白的IMS输入、折叠和活性依赖于MIA40/CHCHD4通路，并且鉴于MIA40/CHCHD4水平在Chchd10突变小鼠中也被发现升高（图2G；数据集EV5），我们想知道CHCHD10不溶性是否可能影响其他与心脏健康相关的线粒体蛋白的不溶性。因此，我们对Chchd10心脏线粒体进行了差异溶解度蛋白质组学分析。在去污剂中溶解心脏线粒体裂解物，然后进行差速离心，使我们能够将可溶性上清部分与不溶性沉淀部分分开。这些部分以及初始未分馏的总输入随后通过质谱进行分析（图4A）。PCA根据基因型区分了WT和Chchd10的总和上清部分，但未区分沉淀部分（图4B）。因此，为了鉴定不溶性候选蛋白，我们将不溶性沉淀部分中的线粒体蛋白相对于在Chchd10突变小鼠总输入中测量的丰度进行绘图，这使我们能够校正单个线粒体蛋白的相对减少，并避免高丰度蛋白仅仅因为其在总输入中表达改变而被错误地归入不溶性沉淀部分（图4C）。通过这样做，我们观察到来自各种线粒体亚区室的大量蛋白质使用此度量显示出相对溶解度降低（图4C），包括MTPP1和细胞色素c。MTPP1是一种IMM蛋白，调节心肌细胞的内膜完整性和生物能量效率（Donnarumma等，2022）。虽然它对成体心脏功能至关重要，但它在心肌细胞中的消融并未重现Chchd10心脏中观察到的生物能量线粒体缺陷或心脏缺陷（Donnarumma等，2022）。细胞色素c是一种可溶性双功能蛋白，在IMM作为电子供体给复合物IV，但当它从线粒体释放到细胞质时，也触发caspase激活和凋亡（Garrido等，2006）。在来自Chchd10突变小鼠的心脏线粒体中，总细胞色素c水平降低了约五倍（Log2FC = -2392，数据集EV7），而不溶性沉淀部分中的相对水平增加（图4C）。为了确定细胞色素c功能障碍是否导致了我们在补充有抗霉素A、TMPD、抗坏血酸和CCCP的分离心脏线粒体中观察到的耗氧率降低（图2O和3F），我们使用从野生型和Chchd10心脏线粒体生成并添加TMDP和抗坏血酸的线粒体颗粒重复了高分辨率呼吸测量法，再次观察到耗氧率显著受损。随后添加外源性牛细胞色素c立即增加了野生型和Chchd10线粒体颗粒的耗氧率，且水平达到统计学上无差异（图4D），这表明来自Chchd10小鼠的线粒体中的细胞色素c缺陷是导致细胞色素c氧化受损的原因，至少在体外检测的分离线粒体颗粒中是这样。在该测定中，将牛细胞色素c注入呼吸室后几秒钟内氧通量增加（图EV4A），这与由细胞色素c间接刺激的mtDNA基因表达导致的间接增加相悖。为了测试Chchd10小鼠是否存在内在的细胞色素c缺陷，我们通过免疫印迹分析了心脏裂解物，揭示在有症状和症状前小鼠中细胞色素c均显著减少（图4E），这与CHCHD10不溶性和积累以及ISR信号传导的动力学平行（图EV3A）。对Chchd10突变心脏的转录组学分析未显示细胞色素c mRNA水平降低（数据集EV1），无法解释稳态蛋白水平的减少，反而暗示细胞色素c的输入和/或稳定性存在缺陷。
细胞色素c在细胞质中合成为不含血红素的血红素蛋白apocytochrome c，其向IMS的输入与血红素连接酶全细胞色素C型合成酶在CXXCH基序上共价连接血红素密不可分（San Francisco等，2013）。在Chchd10和Chchd10/Oma1心脏线粒体中，HCCS和血红素结合蛋白（HEBP1）（后者在啮齿动物中与线粒体功能障碍相关（Yagensky等，2019））的稳态水平降低（图4F），这些线粒体在存在抗霉素A、TMPD、抗坏血酸和CCCP时显示出降低的线粒体呼吸速率（图3F）。基于IMS蛋白筛选差异溶解度蛋白质组学数据揭示，MIA40的底物如COX19、SOD1、ATP23和MIX23受到突变CHCHD10的影响不成比例（图4C），这与IMS蛋白质稳态和/或生物合成缺陷一致（图EV4B）。总之，我们的数据将细胞色素c生物合成缺陷与突变CHCHD10引起的线粒体呼吸受损联系起来，揭示了一个促成Chchd10突变小鼠心脏功能障碍发作的早期生物能量缺陷。
更多结果和补充图表：doi：10.1038/s44321-025-00358-5
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