今天给大家解读一篇3月发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的题目为“Pretreatment of metanephric mesenchymal cells with catalpol mitigates acute kidney injury through VEGF-A secretion via multiple mechanisms.”的文章。本研究针对后肾间充质细胞治疗急性肾损伤疗效有限、机制不清的问题，探讨了经梓醇预处理的MMCs（MMCs-cata）是否能通过调节关键信号通路增强疗效。研究通过体内AKI模型和体外肾小管上皮细胞损伤模型，结合RNA测序、分子对接等多种技术，发现MMCs-cata能显著改善肾功能，其保护作用依赖于VEGF-A的分泌，并进一步揭示了从梓醇激活Wnt通路到VEGF-A/VEGFR2下游信号传导的完整机制链条。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《用梓醇预处理肾旁中胚层细胞通过多种机制促进VEGF-A分泌，从而减轻急性肾损伤》Pretreatment of metanephric mesenchymal cells with catalpol mitigates acute kidney injury through VEGF-A secretion via multiple mechanisms
发表期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：7.3
研究背景：
后肾间充质细胞（MMCs）对急性肾损伤（AKI）具有治疗潜力，但其疗效有限，而且作用机制尚不明确。
研究思路：
- 模型构建与疗效比较
通过顺铂腹腔注射在C57BL6小鼠中建立AKI模型，比较MMCs-cata与未经处理MMCs的治疗效果。 - 关键因子筛选与验证
利用RNA测序分析差异表达基因，并通过蛋白质印迹和ELISA检测MMCs-cata内及其上清液中VEGF-A的水平。 - 核心通路功能验证
建立顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤体外模型，研究VEGF-A上下游信号通路。通过基因沉默、中和抗体及VEGFR2阻断实验，确认VEGF-A/VEGFR2的作用。 - 上游机制探究
通过分子对接模拟和蛋白质印迹实验，探索梓醇对Wnt信号通路的影响。
研究亮点：
-
将中药活性成分梓醇与干细胞（后肾间充质细胞）的预处理策略相结合，以增强其治疗效能。 -
通过体内外功能缺失实验（基因沉默、中和抗体、受体阻断）系统验证了VEGF-A/VEGFR2轴是MMCs-cata发挥保护作用的核心环节。 -
利用分子对接模拟与蛋白质印迹实验，证实了梓醇可直接结合Wnt3A并激活下游经典Wnt通路，阐明了预处理启动VEGF-A分泌的上游机制。
研究结果：
- 功能改善
MMCs-cata能通过抑制炎症、氧化应激和坏死性凋亡，显著改善AKI模型小鼠的肾功能。 - VEGF-A作用确认
RNA测序、蛋白质印迹和ELISA显示，MMCs-cata中VEGF相关基因激活，细胞内和上清液中VEGF-A水平升高。在体内外模型中，沉默MMCs-cata中的VEGF-A、中和上清液中的VEGF-A或阻断肾小管上皮细胞中的VEGFR2，均会消除MMCs-cata的保护作用；而单独补充外源性VEGF-A则能产生保护作用。 - 下游机制
机制研究表明，MMCs-cata激活了p38通路并抑制了STAT3通路。 - 上游机制
分子对接和蛋白质印迹证实，梓醇能够结合Wnt3A，从而激活经典Wnt通路以驱动VEGF-A的分泌。
研究总结：
结果译文：
1.梓醇预处理的后肾间充质细胞更有效地减轻顺铂诱导的急性肾损伤
我们建立了顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）模型，以评估梓醇预处理的后肾间充质细胞（MMCs）对AKI的保护作用。我们之前发现腹腔注射比尾静脉注射更有效（补充图S2）；因此，本实验采用腹腔注射治疗小鼠。我们发现，与注射PBS相比，顺铂给药后注射MMCs的小鼠血清肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）水平较低，其中MMC-cata组的SCr和BUN水平显著低于MMC-con组（图1 C-D）。采用过碘酸-雪夫（PAS）染色评估组织病理学变化。肾小管损伤通过急性肾小管坏死（ATN）评分进行量化。在顺铂诱导的AKI模型中，特征性肾损伤包括肾小管坏死、肾小管扩张、管腔内管型形成以及刷状缘脱落。病理评分显示，MMC-cata和MMC-con组的ATN评分显著低于CP组，其中前者降幅最大（图1 E-I）。Western blot分析显示，MMC-cata组中KIM-1的表达显著低于MMC-con组（图1 J-K）。这些发现表明，梓醇预处理的MMCs能更有效地减轻顺铂诱导的AKI。
2.梓醇预处理的MMCs通过减少炎症、氧化应激和坏死性凋亡来缓解顺铂诱导的急性肾损伤
在注射顺铂的小鼠中，腹腔内给予梓醇预处理的MMCs导致炎症、氧化应激和坏死性凋亡减少。Western blot分析显示，MMC-cata组中炎症标志物p-p65和TNF-α的表达水平显著低于CP组和MMC-con组（图2 A-B）。此外，与CP组相比，MMC-cata组中GSH和T-SOD水平显著升高（图2 C-D），而MDA水平在MMC-cata组显著低于CP组和MMC-con组（图3 E）。坏死性凋亡标志物RIP、RIP3和MLKL及其磷酸化蛋白形式在MMC-cata组的表达水平显著低于CP组和MMC-con组（图3 F-G）。免疫组织化学染色显示，MMC-cata治疗组近端肾小管上皮细胞中坏死性凋亡标志物MLKL的表达低于MMC-con组（图3 H-K）。这些发现表明，梓醇预处理的MMCs对AKI的治疗效果通过减轻炎症、氧化应激和坏死性凋亡的多重途径得到增强。
3.来自MMC-cata的条件培养基通过在体外减少炎症、氧化应激和坏死性凋亡来缓解顺铂诱导的损伤
为了研究MMCs是否分泌某些有助于减轻损伤的有效成分，我们在体外条件下使用来自MMCs的条件培养基处理顺铂损伤的TCMK-1细胞。体外实验表明，与对照细胞相比，用常规MMC条件培养基（con-CM）或梓醇预处理的MMC条件培养基（cata-CM）处理的顺铂损伤TCMK-1细胞表现出细胞活力增加和细胞内LDH水平降低（图3 A-B）。cata-CM组中炎症标志物p-p65和TNF-α的表达水平显著低于CP组（图3 C-D）。与CP组相比，cata-CM组呈现T-SOD活性增加（图3 E），ROS水平降低（图3 F-J），以及坏死性凋亡标志物RIP、RIP3和MLKL及其磷酸化形式的表达水平降低（图3 K-L）。虽然cata-CM和con-CM组在对炎症和氧化应激水平的影响上没有显著差异，但cata-CM组在减轻坏死性凋亡方面表现出更优的治疗效果。这些发现表明，单独应用梓醇预处理的MMC条件培养基可以通过减少炎症、氧化应激和坏死性凋亡来缓解顺铂诱导的TCMK-1细胞损伤。
4.梓醇预处理促进MMCs分泌VEGF-A
为了进一步阐明MMCs发挥治疗作用的机制，我们对正常条件下和梓醇处理后的MMCs进行了RNA测序。在常规MMC和梓醇预处理MMC组之间共有183个差异表达基因，包括95个上调基因和88个下调基因（图4 A）。基因本体论（GO）分析显示，与间充质干细胞分化相关的基因以及与VEGF介导的血小板衍生生长因子诱导增殖相关的通路在梓醇预处理的MMCs中被激活（图4 C）。GO term的基因集富集分析（GSEA）显示，与VEGF合成相关的通路在梓醇预处理的MMCs中被激活（图4 D-E）。来自对照MMCs和梓醇预处理MMCs的条件培养基的ELISA检测表明，梓醇预处理组中VEGF-A的水平显著高于对照组（图4 F）。这些发现表明梓醇预处理促进了MMCs的VEGF-A分泌。结合我们的体内成像结果显示腹腔注射后MMCs主要停留在原位（补充图S3），以及单独使用MMCs条件培养基即可缓解顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的观察，我们推测梓醇预处理MMCs增强的治疗效果可能与VEGF-A的分泌有关。
5.敲低MMCs中的VEGF-A消除了梓醇预处理MMCs对AKI的保护作用
为了验证VEGF-A在梓醇预处理MMCs增强的治疗效果中的作用，我们选择了三种靶向VEGF-A基因不同位点的不同siRNA进行干扰。Western blotting表明，靶向470位点的siRNA3表现出最有效的敲低效果（图5 A-B）。在MMCs转染空质粒或siRNA3质粒后，细胞用梓醇预处理24小时，然后注射到顺铂诱导损伤的小鼠体内。与注射siRNA3处理的MMCs的小鼠和CP组小鼠相比，注射MMCs-cata的小鼠表现出显著较低的SCr和BUN水平（图5 C-D）。采用过碘酸-雪夫（PAS）染色评估组织病理学变化，并通过急性肾小管坏死（ATN）评分量化肾小管损伤。病理评分显示，与CP和siRNA3组相比，MMC-cata组的ATN评分显著降低（图5 E-I）。Western blot分析显示，MMC-cata组中KIM-1和炎症标志物p-p65及TNF-α的表达水平显著低于CP和siRNA3组，而siRNA3组中这些因子的表达水平略低于或类似于CP组（图5 J-K）。此外，与MMC-cata组相比，siRNA3组表现出显著较低的GSH和T-SOD水平（图5 L-M）和显著较高的MDA水平（图5 N）。Western blotting还显示，坏死性凋亡标志物RIP、RIP3和MLKL及其磷酸化形式在MMC-cata组的表达水平显著低于CP和siRNA3组，而siRNA3和CP组之间没有差异（图5 O-P）。免疫组织化学染色显示，与CP和siRNA3组相比，MMC-cata组中MLKL表达显著降低（图5 Q-T）。这些发现表明，敲低VEGF-A基因消除了梓醇预处理MMCs对顺铂诱导的AKI增强的保护作用。
6.中和VEGF-A或阻断VEGFR2消除了梓醇预处理增强MMCs疗效的能力
为了验证VEGF-A是否作为效应分子在梓醇预处理MMCs增强的治疗效果中发挥作用，并鉴定其受体，我们采用了两种方法：中和VEGF-A和阻断VEGF-A发挥作用的受体。由于VEGFR2是VEGF-A的主要受体，我们检测了顺铂损伤小鼠肾脏和TCMK-1细胞中VEGFR2的表达。免疫组织化学染色显示，损伤肾小管中VEGFR2表达增加（图6 A-B），免疫荧光染色显示，顺铂损伤的TCMK-1细胞中VEGFR2的表达显著高于对照细胞（图6 C-D）。体外实验表明，加入0.1 μg/ml VEGF-A中和抗体（VEGF-ab）或10 nM VEGFR2抑制剂（Ki8751）中和了梓醇预处理MMC上清液对TCMK-1细胞的保护作用，导致细胞活力下降和细胞内LDH水平升高（图6 E-F）。Western blot分析显示，VEGF-ab和Ki8751组中炎症标志物p-p65和TNF-α的表达水平高于cata-CM组（图6 G-H），ROS水平升高（图3 J-P），以及坏死性凋亡标志物RIP、RIP3和MLKL及其磷酸化形式的表达增加（图6 Q-R）。相反，加入5 μM MAZ51（一种VEGFR3抑制剂）对cata-CM的治疗效果没有影响。这些发现表明，抑制VEGF-A/VEGFR2轴消除了梓醇预处理MMCs增强的治疗效果。
7.单独应用VEGF-A缓解顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤
为了确定VEGF-A是否是负责MMCs-cata治疗效果的效应分子，单独使用5 ng/ml VEGF-A处理顺铂损伤的TCMK-1细胞。单独VEGF-A处理也缓解了顺铂诱导的TCMK-1细胞损伤，表现为细胞活力增加和细胞内LDH水平降低（图7 A-B）。Western blot分析显示，VEGF-A组中炎症标志物p-p65和TNF-α的表达水平低于CP组（图7 C-D）。此外，VEGF-A组中T-SOD活性增加，ROS水平降低（图7 E-J）。Western blotting证明，VEGF-A组中坏死性凋亡标志物RIP、RIP3和MLKL及其磷酸化形式的表达水平低于CP组（图7 K-L）。加入VEGFR2抑制剂Ki8751后，VEGF-A的治疗效果被消除，表明单独的VEGF-A可以缓解顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤。这些发现表明，VEGF-A可能是MMCs-cata发挥增强保护作用对抗顺铂诱导损伤的效应分子。
8.梓醇预处理MMCs的保护作用可能与抑制STAT3活性和激活p38通路有关
顺铂损伤的肾小管上皮细胞的RNA测序结果提示，顺铂损伤可能抑制MAPK通路并增加STAT磷酸化（补充图S1 B）。因此，我们研究了这两条通路。Western blotting显示，与其他组相比，顺铂损伤组和siRNA3组表现出STAT3及其磷酸化蛋白表达增加，同时p38磷酸化减少。相反，MMC-cata组表现出相反的趋势（图8 A-B）。体外实验显示，顺铂损伤的TCMK-1细胞也表现出STAT3及其磷酸化蛋白表达增加，同时p38磷酸化减少。然而，加入梓醇预处理的MMC条件培养基（cata-CM）或VEGF-A降低了STAT3及其磷酸化蛋白的表达，同时增加了p38磷酸化。这些效应在加入VEGF-A中和抗体（VEGF-ab）或VEGFR2特异性抑制剂Ki8751后被逆转（图8 C-F）。这些发现表明，梓醇预处理MMCs对顺铂诱导损伤的增强保护作用可能与抑制STAT3通路和激活p38通路有关。
9.梓醇通过结合Wnt3A激活经典Wnt通路，促进MMCs中VEGF-A的合成
我们先前的研究表明，梓醇可以激活MMCs中的经典Wnt通路以促进上皮分化。因此，我们使用计算机模拟和实验验证来研究梓醇是否通过激活经典Wnt通路促进MMCs分泌VEGF-A。分子对接显示，梓醇与Wnt3A分子的ILE97形成氢键，并与ARG173形成强静电相互作用。此外，还观察到与PRO46和GLY47等氨基酸的疏水相互作用（图9 A-E，补充表S1）。分子动力学模拟表明，复合系统的RMSD在初始弛豫后保持稳定，小分子与初始对接结构的偏差小于1 Å。复合物和蛋白质受体的构象波动紧密重叠，波动限制在4 Å以内（图9 F）。分子动力学模拟的RMSF统计分析显示，在100 ns模拟过程中，蛋白质的整体骨架保持在5 Å以内，在氨基酸96-106、206-215和291-310区域观察到更高的柔性（图9 G-H），表明小分子与受体蛋白的稳定结合。SPR结果显示，在不同梓醇浓度下，梓醇快速结合Wnt3A。结合的KD值为5.27 × 10⁻⁶ M（图9 J），表明结合力强。Western blotting证明，在1 μM梓醇刺激的MMCs中，VEGF-A表达增加，伴随经典Wnt通路的激活，表现为Wnt3A、β-Catenin和TCF4表达升高。然而，加入经典Wnt通路抑制剂MSAB后，该通路被抑制，VEGF-A、Wnt3A、β-Catenin和TCF4的表达水平降低（图9 K-L）。细胞上清液的ELISA检测显示，MSAB组中VEGF-A水平低于梓醇组（图9 M）。这些发现表明，梓醇通过结合Wnt3A并激活经典Wnt通路，促进MMCs分泌VEGF-A。
更多结果和补充图表：doi：10.1186/s13287-026-04914-9
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