肌萎缩侧索硬化（ALS）的高度异质性长期困扰着临床诊疗。本综述系统梳理了近年来利用转录组学与机器学习对ALS进行分子分型的研究进展。研究发现，通过无监督聚类可稳定识别出氧化应激（ALS-Ox）、胶质活化（ALS-Glia）及转座子激活（ALS-TE）等核心亚型，其中ALS-Gia患者预后最差（中位生存28个月），而ALS-TD亚型预后最佳（42个月）。更重要的是，这些分子特征可在血液中部分复现，为无创分型奠定基础。组织特异性分析显示，同一患者不同脑区的亚型分布存在差异，提示区域病理异质性。这些发现为ALS的精准分型、临床试验分层及靶向治疗开辟了新方向。
今天给大家解读一篇2月发表在《BMC Medicine》上的题目为“Classification of ALS molecular subtypes: a literature review on machine learning applications and their clinical value.”的文章。本文旨在总结和批判性评估近期利用无监督机器学习从转录组数据中识别ALS分子亚型的研究，讨论了这些研究的发现、优势和局限性，并强调了为促使其向生物医学和临床实践转化所必须解决的研究空白与挑战。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！
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题目：《ALS分子亚型的分类：机器学习应用及其临床价值的文献综述》Classification of ALS molecular subtypes: a literature review on machine learning applications and their clinical value
发表期刊：BMC Medicine
影响因子：8.3
研究背景：
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其潜在的生物学机制和临床表现都具有显著的异质性。高维转录组数据集为在分子水平刻画这种变异提供了机会；然而，传统的统计方法难以应对其规模和复杂性。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
采用机器学习方法（特别是无监督学习）来处理高维转录组数据。这些方法可以降低数据维度并 uncovering latent patterns，从而能够识别可能改善预后和支持患者分层的分子亚型。
研究亮点：
- 方法创新性
强调了机器学习方法在处理传统统计方法难以应对的高维、复杂转录组数据方面的优势，能够降维并揭示潜在模式。
- 临床转化价值
明确指出分子亚型的识别有望改善预后判断、支持患者分层，进而通过支持新的实验设计和精准医疗方法来变革ALS研究的各个方面。
研究结果：
- 近期采用无监督机器学习的转录组学研究已经确定了具有 distinct molecular and clinical characteristics 的ALS亚型。
研究总结：
将ALS重新定义为更同质的分子和临床亚型，可以通过支持新的实验设计和精准医疗方法来改变ALS研究的各个方面。本文对这些研究进行了总结和批判性评估，讨论了其发现、优点和局限性，并强调了必须解决的研究空白和挑战，以便将其转化为生物医学和临床实践。
结果译文：
利用机器学习和转录组学探索ALS分子亚型的研究相对较新（图1），首次大规模分子分型研究发表于2019年。该研究使用无监督机器学习分析NYGC ALS联盟的148份死后皮层样本（来自77名ALS患者），识别出三种不同的亚型。最大的一种（占患者61%）以氧化和蛋白毒性应激过程的改变为特征，而第二种（19%）主要表现为胶质细胞活化和炎症特征。第三组（20%）表现出转座子表达升高和通常受TDP-43调控的通路耗竭，从而将该亚型与TDP-43功能障碍联系起来。继这项初步研究之后，几项研究探索了ALS中基于转录组的分型，不仅试图重复这些发现，还探索了这种方法可以提供的各种潜在应用，例如整合额外的数据集和组织类型，应用替代分析方法，或评估这些亚型的预后和临床意义。
另一项研究利用来自208名ALS患者的451个样本，增加了样本量，研究了分子亚型与临床结局（患者生存期和发病年龄）之间的关系。他们发现了与2019年研究一致的三种分子亚型，尽管由于亚群特征化的方法不同而存在一些差异。事实上，考虑到两项研究共有的140个样本，他们观察到样本分类的一致性为85%。然而，更大的样本量和方法学差异促成了ALS-TE亚组被重新定义为ALS转录失调亚型（ALS-TD），并且在属于ALS-TD和ALS-Ox组的样本中均发现特定TE的表达上调。值得注意的是，ALS-TD亚型反映了TDP-43功能障碍的许多标志性通路，包括转录调控受损、隐蔽外显子相关的无义介导的衰变以及转座子和非编码RNA的异常表达，表明TDP-43病理是其转录组谱的基础。临床上，ALS-TD亚型的个体预后较好，中位生存期为42个月（表1）。相比之下，ALS-Ox与较早的发病年龄和中位生存期相关（平均发病年龄60.4 ± 1.16岁，中位生存期36个月），而ALS-Glia表现出最差的预后，中位生存期为28个月，平均发病年龄为63.2 ± 1.83岁（表1）。
基于这些发现，2023年的一项进一步研究探讨了是否也可以从全血RNA-seq数据中从头识别和区分分子亚型。使用来自96名散发性ALS（sALS）患者的样本，他们应用无监督K-means聚类并识别出四个患者亚组。这些聚类的基因表达谱也得到了探索；聚类间的差异基因表达分析识别出5756个亚组定义基因，其中两个聚类相对于所有其他聚类差异表达最多。此外，该研究还对这些亚组定义基因进行了GO生物通路和KEGG通路富集，识别出涉及蛋白水解、RNA剪接、DNA损伤反应和免疫调节的通路，表明外周特征可能反映了对ALS的异质性全身反应。与早期对死后运动皮层组织进行分型的研究不同，这项工作聚焦于全血，这是一种微创且临床可获取的生物样本。尽管由此产生的亚组无法直接与其他研究中已确立的皮层分子亚型对齐，但他们的工作证明了基于血液的转录组学在患者分层中的潜力，并为开发可在疾病进程中纵向监测的可及性生物标志物奠定了基础。
2023年发表的另一项研究进一步探讨了ALS分子亚型在独立队列中的稳健性和临床适用性。使用来自伦敦国王学院脑库的死后运动皮层ALS样本作为发现队列（n=112），他们在来自TargetALS的独立数据集中验证了三种皮层分子亚型（n=93个sALS样本）。为了测试组织特异性和疾病特异性，他们将表达特征投射到枕叶皮层（n=45）和小脑ALS样本（n=128）以及对照运动皮层样本（n=59）上，表明这些亚型主要局限于运动皮层和ALS患者，基于逻辑回归的分类器在区分运动皮层、其他脑区域以及病例与对照之间达到了极佳的判别能力。与早期研究将基因和TE表达计数合并到组合矩阵中进行聚类不同，该研究仅从基因表达数据中推导出亚型，证明即使没有TE特征，分子特征也是稳健的。他们还检验了是否能在ALS患者的外周血中检测到这些亚型，将该模型应用于外周血单核细胞的RNA测序数据（n=15）和全血微阵列数据（n=397）。尽管分离度不如脑组织清晰，但他们报告所有三组的分配概率都很高（80-90%），表明这些亚型至少在血液中得到部分复现，并可能作为患者分层的可及性生物标志物的基础。
2025年，来自进行2019年初步研究的同一实验室的科学家团队在他们最初发现的基础上，通过在他们的NYGC数据集上训练一个深度ALS神经网络分类器（DANCer），生成了一个能够识别NYGC ALS联盟新发布扩展队列中ALS亚型的亚型分配分类器。此外，为了确定这些亚型是否存在于这个新队列中，他们用新的独立样本重新运行了非光滑非负矩阵分解（nsNMF）模型，并识别出与其最初发现一致的3个聚类，即ALS-Ox、ALS-Glia和ALS-TE。至关重要的是，这项研究比较了死后运动皮层和脊髓之间的分子亚型，分析了664个ALS和对照样本。在该数据集中，267名ALS患者同时拥有运动皮层和脊髓样本，允许直接比较同一供体内的亚型分布。分析揭示了显著的组织特异性差异，其中ALS-Glia在皮层中代表最小的组（10%），但在脊髓中占多数（71%），而ALS-TE亚型在脊髓中不存在（图2B）。此外，发现病程与运动皮层中的TDP-43功能障碍和脊髓中的炎症特征相关，突出了这些转录组亚型的临床相关性。
在所有探索和识别ALS脑样本分子亚型的研究中，跨不同队列共识别出5种亚型（图2A）。这包括ALS-Ox、ALS-Glia、ALS-TE、ALS-TD和ALS突触及神经肽信号亚型（ALS-Neu）。值得注意的是，ALS-Ox和ALS-Glia在所有研究和所有团队中均被确立，而ALS-TE、ALS-TD和ALS-Neu仅被个别团队识别（图2A）。2022年的研究识别出ALS-TD亚型，其显示的分子通路与最初在ALS-TE中观察到的通路大体一致，提示转录失调和转座子激活之间存在潜在的机制重叠。然而，虽然TE表达仅特征化了ALS-TE亚型，但在后来的研究中，个别TE的表达是ALS-TD和ALS-Ox的共同特征。大多数已识别亚型的生物学相关性得到了探索ALS发病机制的文献中已充分确立的分子机制的支持。每种亚型都表现出不同的病理过程，包括：氧化应激（ALS-Ox）涉及线粒体功能障碍和活性氧积累，与数十年来证明氧化应激是ALS核心致病机制的研究一致，特别是在SOD1相关疾病中，突变型SOD1已知会产生有毒的活性氧；胶质细胞活化和神经炎症（ALS-Glia）以小胶质细胞和星形胶质细胞功能障碍为特征，验证了先前关于ALS中神经炎症的大量证据，包括显示小胶质细胞活化的早期PET成像研究和死后组织中反应性星形胶质细胞增生的神经病理学发现；转录破坏（ALS-TD）涉及RNA结合蛋白功能障碍，直接证实了通过发现TDP-43、FUS和C9orf72突变（所有这些都编码RNA结合蛋白）而确立的RNA代谢功能障碍的核心作用；以及改变的神经肽信号（ALS-Neu）影响运动神经元存活和突触功能，与ALS中突触功能障碍和神经营养信号改变的新兴证据相一致，超越了传统上对运动神经元死亡的关注。转座子失调（ALS-TE）代表了一种以前在ALS中未被认识的新型致病机制，尽管它已与其他神经退行性疾病和衰老相关。2019年的研究表明，在体外和体内，TE与TDP-43病理和基因组不稳定性相关。
ALS-TE亚型由Tam等人（13）识别，随后由O'Neill等人（12）重复验证，两项研究均利用了NYGC ALS联盟数据集和重叠的团队。该亚型在两项研究中分别约占ALS病例的20%（表1；图2B）。利用额叶和运动皮层组织的单细胞分析，O'Neill等人（12）能够证明属于该表型的样本中，运动神经元中TDP-43功能障碍的证据更强，星形胶质细胞中TE表达升高，以及稳态簇中小胶质细胞的富集增加。
ALS-TE的特征还在于TE表达增加和TDP-43功能障碍；关键分子特征包括异常的逆转录转座子激活、失调的RNA加工和增加的假基因表达（12, 13）。关于该亚型的预后相关性，O'Neill等人（12）发现该亚组中的个体与病程呈显著负相关（r = -0.25, p < 0.05），表明生存时间更短，但未量化这种差异的具体幅度。然而，Tam等人（13）未能建立这种相关性，但确实发现了与肢体起病的关联。
ALS-TE亚型的识别强化了先前关于逆转录病毒在ALS发病机制中潜在关联的观点。可追溯至1990年代至2000年代初的研究探讨了逆转录病毒参与ALS病理的可能性，因为在ALS患者血清中检测到病毒抗体和逆转录酶水平升高，许多临床试验探索了抗逆转录病毒疗法的使用。然而，2011年进行的一项研究确立了人内源性逆转录病毒K（HERV-K）与ALS的关联，这是首次将TE物种与ALS联系起来的研究。2019年的一项后续临床试验探索了Triumeq（一种能够靶向逆转录病毒逆转录酶的抗逆转录病毒药物）长期使用的安全性和耐受性。他们确定长期使用Triumeq对ALS患者是安全的，并且还发现ALSFRS-R评分下降了21.8%。尽管结果看起来很有希望，但仍需要进一步的分子和机制证据来建立更全面的假设，即TE表达和机制有助于疾病的发生。尽管TE失调与衰老和其他神经退行性疾病有关，但此前并未被认为是ALS的主要疾病机制。ALS中TE亚型的发现提供了第一个系统性证据，表明通过逆转录转座子激活的基因组不稳定性构成了相当一部分ALS患者中一个独特的致病通路。该发现直接支持了关于TDP-43在基因组不稳定性中作用的新兴假设，证明TDP-43核功能的丧失导致转座子表达广泛增加。
ALS-Ox亚型在所有研究中都是一致的，并且在各自队列中占ALS病例的最大比例，为25-70%（表1）。该亚型的特征是氧化应激、蛋白毒性应激和线粒体功能障碍增加。其分子特征包括SOD1、OXR1和NEFL的上调，以及氧化磷酸化的改变（10-13）。利用额叶和运动皮层组织的单细胞分析，O'Neill等人（12）识别出运动神经元中与自噬和溶酶体活性相关的基因上调。类似地，Marriott等人（11）使用细胞去卷积分析发现该亚型内星形胶质细胞和内皮细胞的组成更高，而Eshima等人（10）使用相同方法发现其与兴奋性和抑制性神经元相关。此外，属于该组的患者表现出中等的生存结局（36个月）和发病年龄（60 ± 1.16岁）；如表1所示（10）。
2.4 ALS-Glia：神经炎症/胶质细胞活化亚型
属于ALS-Glia亚型的个体在所有研究中代表最小的亚组，范围从10%到21.4%（10-13）。该特定亚型的特征是神经炎症特征和胶质细胞活性增加。细胞组成分析一致显示，与该亚型相关的样本中小胶质细胞、少突胶质细胞、胶质祖细胞和血管细胞的比例增加（10, 11, 13）。单细胞数据的额外证据进一步支持小胶质细胞的富集和活化（12）。该亚型与最差的预后（中位生存期28个月）和最晚的发病年龄（63.2 ± 1.83岁）相关，表明加剧的神经炎症可能与侵袭性的疾病进展相关（表1）（10, 12）。ALS-Glia亚型的识别支持了先前关于ALS中神经炎症的大量证据，包括显示小胶质细胞活化的早期PET成像研究和死后组织中反应性星形胶质细胞增生的神经病理学发现。该亚型通过强化神经炎症在ALS发病机制中的核心作用，并突出以调节小胶质细胞活化和炎症级联反应为重点的潜在治疗靶点，对该领域产生了重大影响，将神经炎症与传统运动神经元变性范式并列，确立为疾病进展的关键驱动因素。
ALS-TD亚组仅在Eshima等人（10）的研究中被识别；占研究样本队列的29.1%。该亚型的个体更易发生转录失调，其特征是假基因、内含子区和长链非编码RNA的异常表达（表1）。然而，尽管该亚型与ALS-TE亚型共享相似的通路，但该聚类中的样本未表现出TDP-43功能障碍，提示调控转录过程的其他潜在机制失调。该研究未能识别出ALS-TD表型与细胞组成之间的任何显著差异，但能够确定具有该表型的个体预后较好（中位生存期：42个月，表1），提示潜在的致病机制可能表现出比其他亚型更不具有侵袭性的特征（10）。
ALS-Neu亚组仅在Marriott等人（11）的研究中被识别。它在研究中代表了最高比例的样本，占53.6%（表1）。该亚型的特征是富集与神经元和突触信号相关的通路，特别是涉及结合和受体相互作用、cAMP和神经活性配体转录通路以及神经肽活性的过程。通过去卷积分析，与其他表型相比，运动神经元在该亚型中显得更为富集（11）。然而，该研究未能确定该表型与发病年龄或病程之间的相关性，尽管它确实报告了与炎症过程的关联。重要的是，该分析未纳入TE数据，因此无法评估如ALS-TE等亚型的存在。未来整合TE表达数据的研究可能有助于确认除ALS-Neu之外的其他亚型的存在。
O'Neill等人（12）进行的研究还探讨了额叶和运动皮层组织与脊髓组织之间亚组的组成。他们发现在亚型分布和特征上存在显著的区域差异。在脊髓组织中，ALS-Glia占主导地位（71% vs. ALS-Ox的29%），这与运动皮层中ALS-Ox更常见形成对比（图2A）。脊髓ALS-Glia样本显示出更强的TDP-43剪接缺陷，而皮层ALS-TE样本则表现出更显著的TE表达（表1）。重要的是，这些组织特异性差异甚至可能发生在同一个体内，对267名同时具有运动皮层和脊髓样本的患者进行的分析显示，大多数患者在不同组织之间表现出不同的分子亚型（12）。这一发现表明，ALS分子亚型对于每个患者来说不是固定的，而是可能因组织而异，突显了ALS病理的区域异质性以及在对亚型进行分类时考虑组织背景的必要性。
尽管转录组亚型最初是在死后的运动皮层组织中定义的，但有两项研究探讨了是否也可以在死前的外周样本中识别它们，从而作为生物标志物。Grima等人（14）研究了散发性ALS（sALS）个体外周血中的诊断性和预后性转录组生物标志物以及分子亚型。对于诊断性生物标志物，作者识别出sALS病例与对照之间差异表达的245个基因，并识别出6个表现出差异表达异构体的基因。这些特征被用于训练随机森林分类模型，该模型能够以78%的准确率区分sALS和对照。该研究还探讨了外周血样本中预后性生物标志物的潜力。他们进行了加权相关网络分析，以确定共表达基因是否与临床特征相关，并能够识别出三个共表达基因模块与样本采集年龄和发病年龄相关。他们还识别出一个与性别差异相关的模块（由25个基因组成）；这些富集的基因特征为参与细菌防御反应。然而，该研究无法利用基因表达谱建立预测病程与实际病程之间的相关性。该研究还探讨了两种形式的患者分层，以研究亚组之间的分子异质性并识别相关生物标志物。他们首先分析了早期和晚期患者与对照组相比的基因表达差异，能够识别出晚期sALS病例与对照之间的279个差异表达基因，但在早期sALS与对照之间仅能识别出一个差异表达基因（C4BPA）。另外，他们应用无监督聚类分析，揭示了四个具有不同基因表达谱的患者聚类，支持了sALS患者中存在潜在分子异质性的观点。这些发现表明外周转录组谱可能反映疾病亚型，尽管需要进一步验证以确定这种聚类是否对应于先前定义的皮层亚型或在独立队列中具有预后价值。
Marriott等人（11）还使用运动皮层bulk RNA-seq与nsNMF训练了亚型分类器，然后将这些特征投射到外周血数据集上，包括PBMC RNA-seq和全血微阵列。他们报告说，ALS-Ox、ALS-Glia和ALS-Neu亚型可以在血液中以高分配概率检测到，尽管组间的分离程度弱于在皮层组织中观察到的。该研究首次提供了证据，表明从死后运动皮层组织衍生的分子程序至少在血液中得到部分保留，支持其作为微创生物标志物的潜力。
Catanese等人（36）作为一项更大规模研究的一部分（其主要目的是研究ALS主要遗传亚型（C9orf72扩张）的转录组景观），探讨了ALS分子表达特征在血液中的存在及其与中枢神经系统样本中特征的关系。他们首先使用深度学习模型在来自荷兰的一个大型血液样本表达数据集（397名ALS患者和645名对照）中识别出一种能够区分病例和对照样本的表达特征。由此产生的基因集富集了与Toll样受体（TLR）级联、免疫反应和自噬相关的基因。通过将他们的血液特征与其他中枢神经系统样本和来自携带C9orf72、FUS、SOD1和TARDBP突变的ALS患者的hiPSC衍生运动神经元的表达数据集进行重叠和分析，他们展示了在所有组织和样本中共同的、能够区分ALS和对照样本的转录改变。尽管这项研究聚焦于ALS的主要遗传亚型以及ALS与对照之间的转录差异，但它提供了强有力的证据，表明有可能识别出在死前和死后样本中至少部分一致的、机器学习衍生的ALS特征。
Eshima等人（10）通过研究同一患者运动皮层和脊髓样本中分子亚型特征的一致性，为跨组织探索亚型转录特征增加了进一步的复杂性。他们发现，亚型分配可能因所分析的个体区域而异，其中ALS-Glia在脊髓中更突出，而ALS-TE在运动皮层中更易检测到。尽管这项研究没有直接扩展到血液，但其结果强调，尽管构成个体亚型特征的部分基因的表达可能在不同组织中得到保留，但整体亚型识别是强烈依赖组织的，这为开发一致的外周生物标志物带来了重要挑战。
最近，O'Neill等人（12）应用单核RNA-seq分析了运动皮层、脊髓和小脑，并探讨了中枢神经组织中定义的分子亚型是否可以在外周血中反映出来。他们发现，与ALS-Ox和ALS-Glia相关的特征确实可以在血液转录组中识别出来，支持这些亚型具有全身性表现的观点。然而，他们也报告说，转录程序通常是区域特异性的，亚型分配可能因所检查的同一供体的组织而异。这一观察结果强化了Eshima等人（10）强调的组织依赖性，并突显了开发可靠的血液生物标志物的前景与挑战。
在这些研究中，某些特征显示出更强的死前检测潜力。ALS-Ox特征性的氧化磷酸化和线粒体应激通路在皮层和外周数据集中均可重复观察到，提示全身性的线粒体功能障碍。类似地，与ALS-Glia相关的主要组织相容性复合体II类、补体活化和干扰素刺激模块在血液来源的免疫细胞中持续检测到，与该亚型的免疫驱动性质一致。相比之下，ALS-TE和ALS-TD的特征，如转座子激活和隐蔽外显子包含，在很大程度上仍局限于皮层组织，迄今为止未在血液中得到强有力的证明。与ALS-Neu相关的特征，包括突触信号传导和轴突导向，在运动皮层中强有力地表征，但在外周样本中观察得不太清楚（11）。综上所述，这些研究表明，死前检测分子亚型是可行的，特别是对于ALS-Ox和ALS-Glia，并且血液来源的转录组数据可以将患者分为生物学上有意义的组。然而，中枢神经系统外组织的可重复性和分辨率仍然有限，并且一些亚型，如ALS-TE和ALS-TD，尚未能在血液中可靠识别。因此，在分子亚型能够转化为临床可操作的生物标志物之前，在独立的、纵向队列中进行前瞻性验证至关重要，而这些发现突出了其在分层临床试验设计和患者富集策略中的潜在效用（10-12, 36）。
更多结果和补充图表：doi： 10.1186/s12916-026-04725-y
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