重磅！体内CRISPR筛选发现表观遗传免疫检查点CBX4！CBX4是PRC1复合物组分，本研究通过体内CRISPR-Cas9筛选（靶向998个表观遗传基因）在肝癌和结肠癌模型中发现：CBX4缺失显著增敏抗PD-1治疗。单细胞转录组和空间转录组显示，CBX4在肿瘤细胞和免疫抑制性TAMs中高表达，与免疫治疗耐药相关。机制上，CBX4通过H3K9me3/H3K27me3修饰沉默内源逆转录元件（ERV）RLTR4-Mm-int；CBX4缺失后ERV去抑制，胞质dsRNA积累，激活RIG-I-MAVS通路，触发I型干扰素应答，重塑炎性TME，增强CD8+ T和NK细胞浸润及杀伤功能。CBX4抑制剂UNC3866联合抗PD-1在PDX模型中显著抑制肿瘤。该研究为表观遗传-神经免疫交叉热点提供了全新靶点，并为ERV激动剂作为免疫增敏剂提供了理论依据！
今天给大家解读一篇3月发表在《The Journal of Clinical Investigation》上的题目为“In vivo CRISPR screens identify CBX4 as an epigenetic regulator for cancer immunotherapy.”的文章。本文报道了一项基于体内CRISPR筛选的研究，发现CBX4是免疫肿瘤微环境的关键负调节因子。通过多组学分析和机制实验，证明CBX4缺失可通过激活逆转座子介导的I型干扰素反应，增强CD8+ T细胞和NK细胞浸润及活性，从而提高ICB疗效；临床数据进一步支持CBX4作为肝细胞癌免疫治疗预后不良的标志物和潜在治疗靶点。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《体内CRISPR筛选鉴定出CBX4作为癌症免疫治疗的表观遗传调节因子》In vivo CRISPR screens identify CBX4 as an epigenetic regulator for cancer immunotherapy
发表期刊：The Journal of Clinical Investigation
影响因子：13.6
研究背景：
表观遗传失调与免疫逃逸和免疫检查点阻断（ICB）耐药相关。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
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使用体内CRISPR-Cas9筛选，在小鼠肿瘤模型（接受ICB治疗）中靶向表观遗传相关因子，以鉴定调控免疫TME的关键基因。
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对接受新辅助抗PD-1治疗的患者样本进行单细胞RNA测序和空间转录组学分析，评估CBX4表达与治疗响应的关联。
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通过基因缺失实验（在巨噬细胞或肿瘤细胞中），探究CBX4对抗肿瘤免疫和ICB敏感性的功能影响。
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机制上，分析CBX4对H3K9me3和H3K27me3标记内源性逆转座子的靶向作用，及其对细胞质RNA感应通路和I型干扰素反应的调控。
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在肝细胞癌患者队列中，分析CBX4表达与免疫响应、逆转座子水平及预后的相关性。
研究亮点：
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采用体内CRISPR-Cas9筛选靶向表观遗传相关因子，直接在小鼠肿瘤模型中探索ICB治疗机制。
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结合单细胞RNA测序和空间转录组学分析，揭示CBX4在肿瘤细胞和免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞亚群中的高表达，尤其在ICB无应答者中优先积累。
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阐明CBX4通过调控H3K9me3和H3K27me3标记的逆转座子，影响细胞质RNA感应通路和I型干扰素反应的分子机制。
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在临床样本中验证CBX4表达与肝细胞癌患者免疫反应、逆转座子水平及预后的负相关性，将基础研究发现与临床应用潜力相联系。
研究结果：
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体内CRISPR筛选鉴定出CBX4为免疫TME的关键负调节因子。
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单细胞和空间转录组学显示：CBX4在肿瘤细胞和免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞亚群中高表达，且在ICB无应答者中优先积累。
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功能实验表明：CBX4在巨噬细胞或肿瘤细胞中的缺失，可诱导强抗肿瘤免疫，增加CD8+ T细胞和NK细胞的浸润及细胞毒性活性，从而增强ICB治疗敏感性。
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机制解析发现：CBX4靶向H3K9me3和H3K27me3标记的内源性逆转座子（如RLTR4-Mm-int）；CBX4缺失导致逆转座子去抑制，激活细胞质RNA感应通路并触发I型干扰素反应，最终形成炎症性TME。
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临床相关性分析：在肝细胞癌患者中，CBX4表达与免疫响应、逆转座子水平及预后呈负相关。
研究总结：
本研究结论认为，CBX4通过表观遗传沉默逆转座子，发挥表观遗传免疫检查点的作用，抑制免疫TME的炎症状态，从而导致ICB耐药。CBX4缺失可重塑免疫TME，增强肿瘤免疫原性，为克服免疫治疗耐药提供了有前景的治疗靶点。讨论强调，这一发现揭示了表观遗传调控与先天免疫响应之间的新联系，并支持CBX4作为癌症免疫治疗中新的生物标志物和干预策略。
结果译文：
1.体内CRISPR筛选鉴定CBX4为免疫逃逸的表观遗传调节因子
为了系统性地鉴定肿瘤细胞中表观遗传相关的免疫逃逸靶点，我们设计了一个慢病毒CRISPR-Cas9筛选文库，包含针对998个表观遗传相关基因的10个sgRNA（以达到足够的覆盖度和高靶向效率，表S1），并将其转导到两种小鼠肿瘤细胞系——Hepa1-6（肝细胞癌）和MC38（结肠癌）中。将转导了sgRNA文库的肿瘤细胞移植到免疫健全野生型小鼠、ICB治疗的野生型小鼠以及作为对照的免疫缺陷NOD SCID II2rg-（NSG）小鼠中，以鉴定具有免疫依赖性效应的sgRNA（图1A）。收集肿瘤后，我们进行了文库质量控制，并观察到由内源性抗肿瘤免疫或ICB治疗驱动的肿瘤生长抑制（图1B、1C和S1A-D；表S1）。除了鉴定出先前文库研究中发现的与ICB耐药相关的基因（如Ezh2、Setdb1、Ep300和Mettl14）外，在免疫压力下，靶向多梳抑制复合物通路的sgRNA在肿瘤细胞中显著耗竭（图1D-E，S1E-G）。在验证实验中，在荷Hepa1-6肿瘤小鼠中，Cbx4、Kdm8、Ezh2或Kdm2a的敲除使肿瘤对抗PD-1治疗敏感（图S1H-K）。值得注意的是，靶向Cbx4（经典多梳抑制复合物的一个组分）的sgRNA在耗竭最显著的sgRNA中排名靠前，突显了其在肿瘤免疫逃逸中的关键作用（图1F）。此外，我们确定了一些因子，其中许多在Hepa1-6或MC38中优先得分。Hepa1-6特异性 hits 包括Sf3b5、Exosc3、Dr1、Exosc9、Eif3k、Dnmt1等。MC38特异性 hits 包括Rbm17、Cul4a、Mettl1、Mettl14、Kat14、Ino80等。这些背景特异性基因也值得进一步研究（图S1E）。
为了进一步研究CBX4在HCC进展中的临床和病理学相关性，我们组建了一个包含108例HCC患者的内部队列（同济队列2，表S2）。排除脱落样本后，共纳入92例配对HCC及癌旁正常组织样本。CBX4在HCC组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且在晚期肿瘤中的表达高于早期肿瘤（图1G和图S2）。同时，对多个临床队列（包括50例分期HCC患者（同济队列3，表S2）以及TCGA和CPTAC数据）的综合分析表明，在多种癌症类型中，CBX4在肿瘤组织中的表达均显著高于癌旁非肿瘤组织（图S2G-H）。进一步分析显示，高CBX4表达与更具侵袭性的肿瘤表型密切相关（图1H）。结合免疫组化评分、转录组、蛋白质组数据、免疫细胞浸润和肿瘤纯度的预后评估一致表明，CBX4表达升高与不良临床结局相关（图1G-I和图S2A-M）。值得注意的是，单变量和多变量Cox回归分析均将CBX4确定为独立的危险因素，突显了其在患者风险分层中的潜在应用价值（图S2N-O）。
我们接下来研究了CBX4与ICB疗效之间的关系。临床上，在多种癌症类型（包括肝细胞癌（同济队列4）（图1J-K；表S2）、结直肠癌、黑色素瘤和尿路上皮肿瘤）中，高CBX4表达与免疫治疗耐药相关（图S3A-C）。为了证实这些关联，我们分析了接受新辅助抗PD-1治疗患者的单细胞RNA测序和空间转录组数据（26），结果显示CBX4在肿瘤细胞和免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞亚群中高表达（图1L-N，和图S3 D-I），并且在非应答者的肿瘤组织中显著富集（图1N和图S3F）。接下来，我们使用JASPAR和PROMO进行转录因子结合基序分析，以鉴定Cbx4的潜在调节因子，确定Maz、E2f1、Usf1和Patz1为首选候选因子（图S4A）。siRNA介导的Maz敲低抑制了Hepa1-6细胞中Cbx4的表达，而在相同条件下，E2f1、Usf1和Patz1敲低对Cbx4表达无影响（图S4B-C）。然后，我们利用JASPAR数据库预测了Cbx4启动子区域上的三个Maz结合位点（P1、P2、P3）。Cut&Tag qPCR证实了Maz与Cbx4启动子上P1和P2位点的结合（图S4D-E）。对多个转录组数据集的关联分析显示，MAZ与CBX4表达呈正相关（图S4F-G）。随后，我们收集了免疫治疗后肝细胞癌患者的组织标本。蛋白质印迹分析显示，与应答者相比，免疫治疗非应答者中MAZ和CBX4的水平显著升高（图S4H-I）。此外，CBX4和MAZ的蛋白水平之间存在显著正相关（图S4K）。总之，这些数据表明，通过体内CRISPR筛选鉴定出的CBX4与癌症患者的肿瘤恶性程度和免疫治疗耐药性密切相关。
2.肿瘤细胞中CBX4的缺失诱导由CD8+ T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫
为了全面评估Cbx4对肿瘤微环境的影响，我们对荷Hep1-6对照或Hep1-6 sgCbx4肿瘤的小鼠模型中分离的细胞进行了单细胞RNA测序（图2A）。无监督流形近似和投影（UMAP）聚类鉴定出六种主要细胞类型（图S5A）。在转导sgCbx4的肿瘤中，瘤内CD45+免疫细胞亚群显示T细胞、NK细胞和DC显著增加，同时Spp1+巨噬细胞显著减少（图2B）。为了进一步研究肿瘤细胞中Cbx4缺失对T细胞亚群的影响，我们对T细胞进行了额外的降维分析（图2C）。我们将T细胞定义为7个亚群，包括效应T细胞（Tef）、增殖性CD8+ T细胞、效应记忆T细胞（Tem）、Treg细胞、初始T细胞、辅助T细胞（Th）和γδT细胞（图S5B）。值得注意的是，在Cbx4缺失的肿瘤组织中，具有细胞毒功能的效应T细胞和增殖性CD8+ T细胞的比例显著增加，同时Treg细胞显著减少（图2D）。肿瘤细胞中Cbx4的缺失显著抑制了Hepa1-6和MC38肿瘤的生长（图2E和图S5L）。流式细胞术分析验证了CD8+ T、CD8+ Tef（IFN-γ+ TNF-α+ 和 Perforin+ granzyme B+）、CD8+ Tpex（PD1+ TIM3- TOX+ TCF1+）、NK和cyto-NK（IFN-γ+ TNF-α+ 和 Perforin+ granzyme B+）的比例和数量增加，而Tex细胞的比例减少（图2F-G，图S5C-K，S5M-T和图S6A）。与这些发现一致，在原位HCC模型中也观察到了类似的结果（图S7A-G）。
为了阐明肿瘤细胞中cbx4缺失引发瘤内免疫微环境激活的潜在机制，我们分析了单细胞测序数据集中的肿瘤细胞簇。基因本体论（GO）和基因集富集分析（GSEA）显示，Cbx4缺失诱导了先天免疫通路的激活，包括通过MHC I类分子进行肽抗原的抗原加工和呈递、对干扰素-β的反应以及先天免疫反应的正向调节（图S8A-B）。接下来，我们分析了sgCbx4肿瘤细胞中与T细胞刺激相关的基因表达。肿瘤细胞表现出抗原呈递机制（B2m、H2-D1）的表达上调，这对T细胞存活和效应分化至关重要（27,28）。此外，Cxcl10（一种对T和NK细胞募集至关重要的趋化因子，与良好的免疫治疗反应相关（29,30））也高水平表达（图S8C）。为了进一步阐明Cbx4对肿瘤微环境的影响，我们进行了一系列体外和体内实验。在共培养实验中，当与表达OVA的Cbx4缺陷型肿瘤细胞（而非NC肿瘤细胞）孵育时，OVA特异性CD8+ T细胞显示出增殖和效应细胞因子产生的显著增加（图S8D-F）。此外，我们将表达OVA的Hepa1-6细胞皮下植入T、B和NK细胞缺陷的Rag-/-γc-/-小鼠中，并通过过继转移OVA特异性CD8+ T细胞模拟CD8+ T细胞介导的免疫压力（图2H）。Cbx4缺陷型肿瘤显著增强了过继转移的T细胞抑制肿瘤生长的功效（图2I）。在将初始NK细胞与Hepa1-6肿瘤细胞共培养时也观察到了类似的结果（图S8G）。我们证实，肿瘤细胞中Cbx4的缺失也使NK细胞能够有效分化为“细胞毒性”表型（IFN-γ+ TNF-α+ 和 Perforin+ granzyme B+）（图S8H）。此外，我们构建了Vector-tagBFP和Cbx4-Sh-tagGFP肿瘤细胞，并以1:1的比例混合进行肿瘤排斥实验（图S8I）。Cbx4-Sh-tagGFP肿瘤细胞更有可能被清除，并且PD-1阻断增强了它们的脆弱性（图S8J），这与临床免疫治疗队列和体内CRISPR筛选中的观察结果一致，即Cbx4低表达预示着更好的总生存期。此外，多重免疫组化显示，小鼠中肿瘤细胞Cbx4缺陷通过增加肿瘤细胞与CD8+ T细胞之间的接触面积，增强了CD8+ T细胞浸润和细胞毒性（图2L）。一致地，来自同济队列2的多重免疫组化（图2J）显示，CBX4表达与CD8+ T细胞和NK细胞的丰度呈显著临床负相关（图2K），而与耗竭T细胞和M2巨噬细胞的存在呈显著正相关（图2K）。
鉴于肿瘤中Cbx4缺失导致CD8+ T细胞和NK细胞的变化，我们首先阐明了sgCbx4对肿瘤生长的抑制作用是否依赖于免疫。我们的数据显示，在NSG小鼠中，靶向Cbx4仅轻微抑制肿瘤生长（图2M）。与先前研究一致，Cbx4缺失可以抑制肿瘤细胞的增殖（31）。然而，在免疫健全的C57BL/6J小鼠中，靶向肿瘤细胞中的Cbx4显著抑制了肿瘤生长。这些结果表明，靶向肿瘤细胞中Cbx4的抗肿瘤功效更依赖于免疫细胞的功能（图2M）。为了探索靶向Cbx4抑制肿瘤进展过程中需要哪些特定的免疫细胞亚群，使用耗竭抗体选择性地清除CD8+ T细胞、NK细胞或CD8+ T/NK细胞（图S8K）。我们的结果表明，清除CD8+ T细胞和NK细胞消除了Cbx4缺失对肿瘤进展的影响（图2N）。这些发现表明，靶向Cbx4依赖于CD8+ T细胞和NK细胞抑制肿瘤生长，这促使我们集中研究Cbx4促进肿瘤细胞抵抗CD8+ T细胞和NK细胞依赖性细胞毒性的潜在机制。
3.巨噬细胞中CBX4的缺失通过CD8+ T细胞和NK细胞诱导抗肿瘤免疫
基于接受新辅助抗PD-1治疗患者的单细胞RNA测序和空间转录组学，我们观察到CBX4在非应答者肿瘤组织中的免疫抑制性TAM亚群中高表达，表明巨噬细胞中的CBX4也可能在免疫逃逸中发挥关键作用（图1M和图S3F）。免疫荧光染色显示，肝细胞癌组织中CBX4和巨噬细胞显著共定位（图S9A）。此外，CBX4的表达水平与CD68（巨噬细胞标志物）呈高度正相关，且高CBX4和CD68表达与不良临床结局相关（图S9A-C）。因此，我们构建了LysM Cre Cbx4 fl/fl 髓系细胞条件性敲除小鼠。为了全面评估髓系细胞中Cbx4缺失对肿瘤微环境的影响，我们富集了CD45+免疫细胞，对从野生型和LysM Cre Cbx4 fl/fl 小鼠的Hep1-6肿瘤组织中分离的细胞进行了单细胞RNA测序（图3A）。我们鉴定出10个不同的细胞簇，包括T细胞、NK细胞、B细胞、DC、C1qc+巨噬细胞、Arg1+巨噬细胞、成纤维细胞样巨噬细胞、单核细胞和一个未知细胞亚群（图S10A）。跨条件的比较簇动力学分析显示，在LysM Cre Cbx4 fl/fl 小鼠的肿瘤中，T细胞、NK细胞和C1qc+巨噬细胞（被认为是M1样亚群）（32）显著增加，同时Arg1+巨噬细胞（被认为是M2样免疫抑制亚群）（32）显著减少（图3B）。为了进一步研究髓系细胞中Cbx4缺失的影响，我们对髓系细胞进行了额外的降维分析（图3C）。我们将髓系细胞定义为9个亚群，包括C1qc+巨噬细胞、Spp1+巨噬细胞、Ccr2+巨噬细胞、Dcn+巨噬细胞、Cle9a+ cDC1、H2-Ab1+ cDC2、Ccr7+ cDC3、Siglech+ pDC和一个未知亚群（图S10B）。值得注意的是，M1样C1qc+巨噬细胞和Ccr2+巨噬细胞的比例显著增加，同时免疫抑制性Spp1+巨噬细胞显著减少（图3D）。然而，Cle9a+ cDC1、H2-Ab1+ cDC2、Ccr7+ cDC3、Siglech+ pDC的比例仅显示轻微变化（图3D），并且DC中Cbx4的表达水平显著较低（图S3H），这表明Cbx4的缺失主要通过巨噬细胞相关亚群发挥其功能。值得注意的是，基因差异分析和GSEA显示，巨噬细胞中Cbx4的缺失促进了先天免疫通路的激活（图3E-F）。为了验证我们的单细胞发现，我们对HCC、黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型进行了流式细胞术。巨噬细胞中Cbx4的缺失显著抑制了肿瘤生长（图3G-I）。与单细胞发现一致，来自HCC和黑色素瘤的LysM Cre Cbx4 fl/fl 组的流式细胞术结果显示，总肿瘤相关巨噬细胞的比例没有显著变化（图3J和L）。然而，LysM Cre Cbx4 fl/fl 组中CD86+ TAM的比例显著更高，同时免疫抑制性CD206+巨噬细胞显著减少（图3N和P）。同时，MHC I类分子和PD-L1的表达显著增加（图3K、M、O和Q）。为了阐明巨噬细胞的抗原呈递能力，我们将初始OT-I CD8+ T细胞与负载ova257-264肽的野生型或LysM Cre Cbx4 fl/fl BMDM共培养。一致地，共培养实验和流式细胞术显示，Cbx4缺失的TAM表现出增殖和效应细胞因子产生的显著增加（图3R-U）。此外，来自Hep1-6和B16荷瘤组织的多重免疫组化显示，巨噬细胞中Cbx4缺陷通过增加巨噬细胞与CD8+ T细胞之间的接触面积，增强了CD8+ T细胞浸润，表明在Cbx4缺失下巨噬细胞与CD8+ T细胞之间存在更多的细胞间相互作用和通讯（图3V-W）。
为了进一步研究巨噬细胞中Cbx4缺陷对T细胞亚群的影响，我们对T细胞进行了额外的降维分析（图4A）。我们将T细胞定义为7个亚群，包括Gzmb+ CD8+ T细胞（Tef）、Top2+ CD8+ T细胞（增殖性CD8+ T细胞）、Tnfsf8+ T细胞、Treg细胞、Left+ T细胞（初始T细胞）、Il23r+ Th17细胞和Fth1+ T细胞（图4C）。值得注意的是，在LysM Cre Cbx4 fl/fl 小鼠的肿瘤中，具有细胞毒功能的效应CD8+ T细胞的比例和数量显著增加，同时Treg细胞显著减少（图4B）。T细胞和NK细胞中的差异表达基因显示，巨噬细胞中Cbx4的缺失重塑了炎性肿瘤微环境（图4D-E）。来自HCC和黑色素瘤的流式细胞术结果验证了CD8+ T（图4F和图S11A）、CD8+ Tef（IFN-γ+ TNF-α+ 和 Perforin+ granzyme B+）（图4H-I和图S11C-D）、CD8+ Tpex（PD1+ TIM3- TOX+ TCF1+）（图4M）、NK（图4G和图S11B）和cyto-NK（图4J-K和图S11E-F）的比例和数量增加，而Tex细胞（PD1+ TIM3+ 和 PD1+ LAG3+）的比例减少（图4L和图S11G-H）。与这些发现一致，在原位HCC模型中也观察到了类似的结果（图S12A-G）。此外，多重免疫组化显示，巨噬细胞中Cbx4缺陷增强了CD8+ T细胞和NK细胞的浸润和细胞毒性（图S11I）。鉴于巨噬细胞中Cbx4缺失导致CD8+ T细胞和NK细胞的变化，我们通过选择性清除CD8+ T细胞、NK细胞或两者来进一步阐明这些特定免疫细胞亚群的作用（图S11J）。我们的结果表明，清除CD8+ T细胞和NK细胞消除了巨噬细胞中Cbx4缺失对肿瘤进展的影响（图S11J-K）。这些发现表明，巨噬细胞中Cbx4缺失以CD8+ T细胞和NK细胞依赖的方式促进抗肿瘤免疫，这可能与肿瘤细胞中Cbx4缺陷的机制相似。
4.CBX4缺失通过激活RIG-I-干扰素信号触发抗病毒免疫应答
T细胞和NK细胞在其效应功能中并非自主的。靶向再激活T细胞和NK细胞需要协调的细胞间相互作用和通讯，包括趋化因子的分泌、干扰素相关通路和抗原呈递通路的激活（6,33-35）。鉴于肿瘤细胞和巨噬细胞中的Cbx4缺陷均触发CD8+ T和NK细胞介导的抗肿瘤免疫，我们利用CellPhoneDB基于scRNA-seq数据推断肿瘤细胞/巨噬细胞与T细胞/NK细胞之间的相互作用（图5A）。值得注意的是，我们观察到Cbx4缺陷的肿瘤细胞/巨噬细胞与T细胞/NK细胞之间的相互作用显著增加，包括炎症细胞因子（如TNFα、IFNβ、IFNγ和白介素-1家族成员IL1b、IL15和IL18（对T细胞和NK细胞存活及效应分化至关重要）（35-37））、趋化因子（如Cxcl9和Cxcl10（对T和NK细胞募集至关重要）（15,29,30））以及HLA-E-NKG2D轴（对激活T细胞和NK细胞的细胞毒功能至关重要）（38,39）的相互作用（图5A）。随后，我们对Cbx4缺陷的肿瘤细胞/巨噬细胞与对照进行了KEGG和GSEA分析，以查询标志性通路数据库。分析显示，肿瘤细胞和巨噬细胞中Cbx4缺失均导致多个免疫相关通路的上调，如I型干扰素反应、RIG-I样受体信号和胞质DNA感知通路、抗原加工和呈递通路等（图5B-C和图S13A）。一致地，肿瘤细胞和巨噬细胞中Cbx4缺陷导致RIG-I、MAVS、cGAS以及磷酸化IRF3、IRF7、STAT1和Nfkb的mRNA和蛋白水平升高（图5D-F）。临床上，来自HCC患者（同济队列）、黑色素瘤和结直肠癌肿瘤组织的差异表达基因进一步揭示，CBX4表达与参与抗原呈递（MHC I相关）、先天免疫和T细胞活化的基因呈负相关（图5G和图S13B-C）。一致地，多重细胞因子检测显示，在Cbx4缺陷的肿瘤细胞/巨噬细胞荷瘤小鼠中，炎症细胞因子广泛上调（图S13D-E）。
我们接下来通过敲低不同的dsDNA和dsRNA传感器，评估了先天免疫受体通路在Cbx4缺失诱导的IFN激活中的作用。有趣的是，cGAS的缺失仅轻微降低了巨噬细胞中Cbx4缺失诱导的IFN信号，表明cGAS/Sting1通路似乎不是Cbx4缺失诱导IFN信号的关键介质（图5H）。相反，RIG-I的缺失完全逆转了Cbx4缺失诱导的ISG和炎症基因表达，表明RIG-I是关键介质（图5H）。为了确定Cbx4是否主要通过RIG-I样受体信号通路影响肿瘤进展和免疫微环境重塑，我们构建了稳定的Cbx4/Rig-i双敲除、Cbx4/cGAS双敲除、Cbx4/Mavs双敲除和Cbx4/Sting1双敲除的Hepa1-6细胞系（图5I）。荷瘤小鼠模型数据和多重细胞因子检测显示，Rig-i缺失削弱了与Cbx4缺陷相关的肿瘤抑制和免疫调节效应（图5I-K和图S13F）。总之，这些发现表明，肿瘤细胞和巨噬细胞中Cbx4的缺陷介导了一种共同的机制，即通过RIG-I受体信号通路重塑肿瘤微环境。
5.CBX4抑制H3K9me3和H3K27me3标记的内源逆转录转座子
RIG-I受体信号通路可被内源双链RNA激活，包括错误剪接的转录本和内源逆转录病毒（ERV），它们是胞质dsRNA的主要贡献者（40,41）。然而，在Cbx4缺陷的肿瘤细胞或巨噬细胞中，剪接体相关通路没有富集（图S8A和图5B）。我们推测Cbx4缺陷激活了ERV和内源核酸感知通路。使用dsRNA特异性抗体（J2）染色，我们在人样本中检测到，与高CBX4表达的非应答者相比，低CBX4表达的抗PD-1应答者中dsRNA水平更高（图6A）。此外，体外和体内实验均证实，靶向Cbx4诱导了细胞质和肿瘤组织中dsRNA的积累（图6B-C）。RNA-seq分析显示，来自逆转录转座子的双向转录本增加，包括含有长末端重复序列的ERV和非LTR元件，例如RLTR4-Mm-int，这是在TAM中Cbx4缺失诱导的最主要的ERV（图6D-F）。在Hepa1-6肿瘤细胞中也观察到了类似的结果（图S14A）。调节ERV表达的基本表观遗传机制包括DNA甲基化和组蛋白修饰（42）。然而，MethylFlash全球DNA甲基化（5-mC）ELISA检测显示，巨噬细胞和肿瘤细胞中Cbx4缺失并未显著改变全局DNA甲基化水平，表明Cbx4缺失引起的ERV表达激活可能是由组蛋白甲基化修饰诱导的（图S14B-C）。逆转录转座子的沉默主要由抑制性H3K9me3和H3K27me3异染色质控制（43-45）。最近的研究表明，作为PRC1复合物一部分的Cbx4，可与组蛋白H3在“Lys-9”位点的三甲基化（H3K9me3）和H3在“Lys-27”位点的三甲基化（H3K27me3）结合（46），表明Cbx4可能通过染色质重塑和组蛋白修饰来调节ERV表达。接下来，我们证明了TAM和肿瘤细胞中Cbx4缺陷降低了H3K9me3水平和H3K27me3水平（图6G-H）。Cbx4的缺失导致H3K9me3和H3K27me3抑制性标记在RLTR4-MM-int位点的结合减少（图6I和图S14E）。
在巨噬细胞中敲低最主要的Cbx4缺失诱导的ERV——RLTR4-Mm-int，降低了I型干扰素反应，而不影响其他ERV的表达（图S14D和F）。此外，为了确定Cbx4是否主要通过激活RLTR4-Mm-int影响肿瘤进展和免疫微环境重塑，我们构建了稳定的Cbx4/RLTR4-Mm-int双敲低的Hepa1-6/MC38细胞系（图6J-K）。我们的发现表明，RLTR4-Mm-int敲低恢复了与Cbx4缺陷相关的肿瘤抑制和免疫调节效应（图6J-K）。为了更好地确定RLTR4-Mm-int的潜在治疗价值，我们设计了用于体内治疗的ERV：RLTR4-Mm-int（图6L）。瘤内注射ERV：RLTR4_Mm_int显著抑制了Hep1-6和MC38肿瘤的生长（图6M-N）。流式细胞术显示，ERV：RLTR4_Mm_int增加了CD8⁺ T、CD8⁺ Tef（IFN-γ⁺ TNF-α⁺ 和 Perforin⁺ granzyme B⁺）、CD8⁺ Tpex（PD1⁺ TIM3⁻ TOX⁺ TCF1⁺）、CD8⁺ Tprof（Ki67⁺）、早期活化CD8⁺ T（CD69⁺）、NK和cyto-NK（IFN-γ⁺ TNF-α⁺ 和 Perforin⁺ granzyme B⁺）的比例，而Tex细胞（PD1⁺ TIM3⁺ 和 PD1⁺ LAG3⁺）的比例减少（图S15A-B）。体外和体内实验表明，ERV：RLTR4_Mm_int诱导炎症因子的表达和释放，从而重塑免疫抑制性肿瘤微环境（图S15C-F）。然后，我们在免疫健全小鼠的HCC和CRC模型中引入了ERV：RLTR4_Mm_int与PD-1阻断的单药或联合治疗（图6O-P）。正如假设的那样，其与免疫检查点阻断的联合进一步增强了治疗效力，产生了强效且持久的抗肿瘤反应（图6O-P）。
为了探索CBX4与已知ERV表达表观遗传调节因子之间的潜在相互作用，我们使用抗CBX4抗体进行了免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）。我们的结果表明，CBX4与表观遗传调节因子EZH2（主要靶向H3K27me3）和SETDB1（主要靶向H3K9me3）特异性相互作用（47,48），表明CBX4可能通过与这些因子形成多蛋白复合物来抑制ERV表达。相反，我们没有观察到CBX4与EP300或KDM5B之间的相互作用（图S16A-C）。为了评估组蛋白甲基化的药理调节是否能逆转CBX4介导的免疫抑制，我们使用针对组蛋白标记H3K9me3和H3K27me3的特异性抑制剂进行了挽救实验，这些标记受CBX4调节。我们选择了SETDB1特异性抑制剂（SETDB1-TTD-IN-1）和EZH2特异性抑制剂（GSK126）在随后的挽救实验中药理学抑制H3K9me3和H3K27me3水平。然后，我们构建了稳定过表达Cbx4的肿瘤细胞系，并进行了皮下肿瘤植入实验。正如预期的那样，Cbx4过表达显著减少了肿瘤浸润的CD8+ T细胞和NK细胞的比例。重要的是，用H3K9me3或H3K27me3抑制剂治疗有效地破坏了这种免疫抑制微环境，恢复了免疫细胞浸润并抑制了肿瘤进展（图S16D-M）。这些数据表明，靶向组蛋白甲基化可以在功能上逆转CBX4诱导的免疫逃逸。
为了更好地增强临床相关性，我们还分析了抗PD-1治疗前采集的黑色素瘤预处理肿瘤样本的RNA-seq数据集（49）。我们发现CBX4表达与ERV（如ERVmap_2550、ERVmap_2192、ERVmap_705等）呈负相关，这些ERV在对抗PD-1治疗有完全缓解的患者中表达显著高于疾病进展患者（图S17A-C）。总之，我们证明了肿瘤细胞和巨噬细胞中Cbx4的缺陷介导了一种共同的机制，即通过去抑制H3K9me3和H3K27me3标记的内源逆转录转座子RLTR4-MM-int来重塑肿瘤微环境。ERV：RLTR4_Mm_int可能作为增强抗肿瘤免疫和癌症免疫治疗的治疗靶点。
6.靶向CBX4诱导抗肿瘤免疫并增强PD-1阻断的体内抗肿瘤效果
为了更好地理解同时缺失两个区室中的Cbx4将如何影响肿瘤进展和免疫反应，我们使用Hepa1-6和B16荷瘤小鼠模型，比较了单独缺失肿瘤细胞和巨噬细胞中Cbx4以及联合缺失Cbx4的效果。联合缺失Cbx4显著抑制了肿瘤生长，并诱导了更多的效应T细胞和NK细胞（图7A-B和图S18A-F）。接下来，使用Hepa1-6和mc38荷瘤小鼠模型，我们证明巨噬细胞（图7C-D）或肿瘤细胞（图7E-F）中CBX4缺失均能增强抗PD-1免疫治疗的疗效。一致地，我们观察到抗PD-1与巨噬细胞中CBX4缺失的联合治疗并未改变总肿瘤相关巨噬细胞的比例（图S19A），但增加了MHC I类分子的表达（图S19B）。然而，联合治疗组中CD86+ TAM的比例显著更高，同时免疫抑制性CD206+巨噬细胞显著减少（图S19C-D）。重要的是，细胞毒性CD8+ T细胞、NK细胞和细胞毒性TNFα+ IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例显著增加（图S19E-G），联合治疗进一步增强了这一效应。为了评估靶向CBX4的治疗价值，我们用CBX4抑制剂UNC3866、抗PD-1抗体或其联合治疗Hepa1-6和B16荷瘤小鼠，并监测肿瘤生长。我们注意到，在Hepa1-6和B16荷瘤小鼠模型中，CBX4抑制与抗PD-1抗体的联合使用显著减缓了肿瘤生长（图7G-H）。一致地，我们观察到总肿瘤相关巨噬细胞的比例没有显著变化（图S19H）。然而，联合治疗组中CD86+ TAM的比例显著更高，同时免疫抑制性CD206+巨噬细胞显著减少（图S19J-K）。同时，具有抗原呈递能力的MHC I类分子的表达显著增加（图S19I）。重要的是，UNC3866单药治疗后CD8+ T细胞、NK细胞和细胞毒性TNFα+ IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例显著增加，联合治疗进一步增强了这一效应（图S19L-N）。UNC3866在Rag-/-γc-/-小鼠中仅轻微抑制肿瘤生长。然而，在免疫健全的C57BL/6J小鼠中，UNC3866显著抑制了肿瘤生长，并增加了CD8+ T细胞和NK细胞的比例（图S19Q-R）。这些结果表明，UNC3866通过免疫介导的方式限制肿瘤生长，更依赖于免疫细胞的功能。为了更好地模拟对免疫治疗的临床反应，我们使用来自具有不同CBX4表达和免疫治疗结果的个体的新鲜切除HCC标本，在人性化NSG小鼠中建立了患者来源异种移植（PDX）模型。与对照组相比，UNC3866单药治疗显著抑制了肿瘤生长并减少了肿瘤负荷。正如假设的那样，其与免疫检查点阻断的联合进一步增强了治疗效力，产生了强效且持久的抗肿瘤反应（图7I-J）。总之，这些发现表明，CBX4是一个有前景的治疗靶点，能使肿瘤对免疫检查点阻断敏感，为增强抗肿瘤免疫提供了一种引人注目的联合治疗策略。这些结果突显了表观遗传-免疫共靶向作为一种增强癌症免疫治疗的有前景且临床可行的策略。
更多结果和补充图表：doi： 10.1172/JCI200564
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