急性髓系白血病（AML）表面抗原异质性导致免疫治疗靶点选择困难。本研究构建了26例AML患者诊断-复发配对样本的多组学图谱，整合CITE-seq（同时测转录组+81种表面蛋白）和定量流式细胞术，共计378,284个单细胞。通过随机森林机器学习将CITE-seq抗体衍生标签转化为每个细胞表面抗原的绝对分子数，首次实现单细胞水平抗原密度的系统量化。发现CD33、CLL-1等已知靶点及LAIR1、ITGA4、DEC-205、CD244四个新候选抗原在AML原始细胞和LSC富集群体中高表达（≥80%阳性，≥1000分子/细胞），而在非造血健康组织中低表达。体外ADCs和CAR-T实验证实，双靶向（CD33+CLL-1或CD33+新抗原）策略可有效杀灭抗原异质性混合细胞，而单靶向则无法清除阴性亚群。该资源为设计OR-gate多靶向免疫疗法提供了系统框架。
今天给大家解读一篇3月发表在《iScience》上的题目为“A multimodal atlas for immunotherapeutic targeting of AML surface heterogeneity.”的文章。本研究旨在解决AML因瘤内异质性导致的高复发率和治疗选择有限的问题。研究团队对26名成年AML患者配对的诊断与复发骨髓样本进行了CITE-seq和定量流式细胞术分析，构建了一个多模态纵向单细胞图谱。通过整合两种技术的数据，系统量化了单个白血病细胞的表面抗原共表达，并利用机器学习模型预测了抗原的绝对数量。基于此，研究筛选出在AML细胞上高表达、在非造血健康组织中低表达的潜在靶点，并通过体外ADC和CAR-T细胞实验验证了其靶向性及多靶向策略的优越性。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《用于AML表面异质性免疫治疗靶向的多模态图谱》A multimodal atlas for immunotherapeutic targeting of AML surface heterogeneity
发表期刊：iScience
影响因子：4.1
研究背景：
AML是一种具有高复发率的血液恶性肿瘤，患者间及患者体内存在广泛的肿瘤异质性，导致治疗选择有限。尽管免疫治疗在其他血液肿瘤中取得成功，但由于缺乏癌特异性抗原及显著的靶点表达异质性，在AML中的应用受限。单细胞技术虽能解析遗传异质性，但在单细胞水平系统量化表面蛋白组仍具挑战，限制了我们对表面抗原可靶向性的理解。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 样本与数据生成
收集26名AML患者配对的诊断与复发骨髓单个核细胞样本，使用CITE-seq同时分析转录组和81种表面抗原，并使用定量流式细胞术精确量化CD33、CLL-1等关键抗原的表达。
- 图谱构建与异质性分析
整合CITE-seq数据，识别细胞类型，重点分析白血病原始细胞，并通过投影到健康造血参考图谱来定义原始细胞的谱系状态，量化其异质性及诊断-复发间的变化。
- 抗原定量整合
利用机器学习模型，将定量流式获得的绝对抗原数量与CITE-seq的相对信号关联，从而预测所有81种抗原在单个细胞上的估计分子数。
- 靶点筛选与验证
基于抗原阳性率、估计抗原数量（设定阈值）及在非造血健康组织中的低表达，筛选潜在靶点。通过定量流式验证筛选靶点的表达，并使用ADC和CAR-T细胞在AML细胞系中进行体外细胞毒性实验，验证单靶点及多靶点策略的有效性。
研究亮点：
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构建了26对匹配的AML诊断与复发样本的单细胞免疫表型图谱。
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靶向新出现的表面抗原的ADC和CAR-T细胞在体外可诱导细胞毒性。
研究结果：
- 图谱与细胞状态异质性
成功构建包含378,284个细胞的多模态AML图谱。原始细胞显示出显著的谱系状态异质性，可分为干细胞样、祖细胞样和分化表型样等状态，且在诊断与复发间存在可塑性变化。携带TP53、TET2等基因突变的样本其原始细胞状态多样性更高。诊断与复发间原始细胞状态组成变化大（Aitchison距离高）与患者总生存期改善相关。
- 单细胞抗原数量估计
通过机器学习模型整合CITE-seq与定量流式数据，成功预测了单个原始细胞表面抗原的估计数量。验证表明模型预测的平均抗原数量与流式测量结果具有一致性。
- 靶点筛选
基于≥80%阳性率、≥1000个抗原/细胞的阈值，并结合在非造血组织中低表达的标准，从81种抗原中筛选出CD33和CLL-1（已知靶点），以及LAIR1、ITGA4、DEC-205、CD244四个前景靶点。这些靶点在大部分患者样本的原始细胞和白血病干细胞富集群体中符合标准。
- 体外验证
- 靶点表达验证
定量流式证实了LAIR1等四个前景靶点在AML原始细胞和LSC富集群体中高表达，且与模型预测值高度一致。
- 靶向性验证
使用ADC或CAR-T细胞靶向这六个抗原，均在表达相应抗原的AML细胞系中诱导出特异性细胞毒性，而在敲除细胞中效果甚微。
- 多靶向策略优势
在模拟AML异质性的混合细胞实验中，单靶点ADC治疗的杀伤效果依赖于抗原阳性细胞比例，而同时靶向CD33与另一个抗原（如CLL-1， LAIR1等）的联合ADC或双特异性CAR-T策略，则能几乎完全清除所有细胞，证明了多靶向策略克服抗原异质性的优势。
研究总结：
本研究构建的纵向多模态单细胞AML图谱是一个宝贵的资源，能够量化单个细胞表面抗原的数量与共表达。研究验证了CD33和CLL-1，并新识别出LAIR1、ITGA4、DEC-205和CD244四个有前景的免疫治疗靶点。体外实验证明，针对这些抗原的多靶向策略能更有效地根除异质性AML细胞群体，为设计新型免疫疗法提供了框架。 讨论指出，尽管这些靶点在非造血组织中表达低，但仍广泛表达于健康造血细胞，可能引发靶向/脱瘤毒性。然而，基因编辑造血干细胞移植等新兴策略有望解决这一问题。本研究所建立的抗原量化与共表达分析框架不局限于ADC和CAR-T，也可指导其他免疫疗法（如T细胞衔接器）的开发。研究局限性包括未深入探讨微环境影响，以及未进行单细胞突变谱分析。未来工作将扩大队列、进行体内评估，并开展临床相关性研究。
结果译文：
AML图谱构建的示意图如图1A所示。从2004年至2018年间，我们获取了26例成人AML患者的诊断和复发配对骨髓单个核细胞样本。我们进行了CITE-seq，以单细胞分辨率同时分析转录组和81种表面蛋白的表达，从而生成一个多模态、纵向的AML图谱，包含378,284个细胞。通过挖掘大量AML患者样本的现有表面表达流式细胞术和质谱数据来选择抗原靶点。该panel还包括细胞表型标志物。与此同时，使用QuantiBRITE微球的流式细胞术用于定量4种AML相关靶抗原（CD33、CLL-1、CD123和ADGRE2）在原始细胞和白血病干细胞富集群体中的表面表达。选择这些抗原是因为它们经过广泛的临床前和临床评估，可通过不同方式靶向，并且它们在AML原始细胞上的表达代表了从每个细胞200到10,000个抗原的广泛表面表达强度分布。定量流式实验允许精确测量表面抗原阳性率以及原始细胞和LSC富集群体中的平均抗原数量。当与CITE-seq配对时，这些数据构成了一个全面的资源，用于研究瘤内演变、量化表面抗原共表达，并评估所有26个配对BMMC样本中原始细胞群体表面抗原的可靶向性。
CITE-seq基因表达的聚类分析揭示了不同的细胞群体，对应于单核细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞和红系细胞，这些基于经典细胞类型表面标志物进行鉴定。其余细胞聚集在一起，并显示出中等的CD45表面表达（CD45中），这与流式细胞术中用于鉴定CD45中原始细胞的标准一致。CD45表面表达与编码CD45的PTPRC表达显示出强烈的一致性，将它们鉴定为白血病原始细胞。每个样本中原始细胞的百分比与流式细胞术数据相关，其中原始细胞对应于具有低侧向散射的CD45中群体。为了建立健康造血系统的单细胞参考，我们对10例健康供体的BMMC样本进行了CITE-seq，揭示了预期的造血谱系，包括造血干细胞和祖细胞、髓系、淋巴系和红系细胞群体。
对bulk AML样本的基因组研究已有效表征了患者间的分子异质性，但白血病原始细胞状态的瘤内演变仍有待深入研究。原始细胞群体的UMAP显示，不仅在患者之间存在显著的细胞状态异质性，而且在同一患者不同时间点的诊断和复发样本之间也存在这种异质性。为了表征这种异质性，我们通过将原始细胞的转录组谱投射到使用Seurat转移锚点的健康注释造血参考上，将其分类为谱系状态层级，并检查了基因和表面抗原标志物的表达。造血干细胞样、粒-单核祖细胞样、巨核-红系祖细胞样、前体/祖B细胞样、巨核细胞祖细胞样、成红细胞样、单核细胞样、常规树突状细胞样和浆细胞样树突状细胞样原始细胞分别占AML图谱中所有原始细胞的59.7%、11.4%、2.51%、7.78%、0.35%、0.04%、17.4%、0.76%和0.008%。在不同样本中观察到组成差异，包括来自同一患者不同时间点采集的样本，表明原始细胞状态是可塑的，并且在诊断后不局限于特定谱系。我们还观察到，这些状态在复发时可表现出更干样或更分化的表型，患者之间没有明显或一致的轨迹。此外，我们观察到26例AML患者中有17例的诊断或复发样本包含>50%的HSC样或LSC富集原始细胞，如CD34⁺CD38⁻免疫表型所示。
这促使我们使用Shannon指数作为相对指标来分析原始细胞谱系状态的总体多样性。当将这些指数值与bulk DNA测序结果进行比较时，我们发现携带肿瘤抑制基因和信号转导基因突变的样本与携带其他突变的样本相比，显示出显著更高的原始细胞谱系状态多样性。这些结果表明基因组不稳定性和致癌信号在破坏白血病原始细胞中造血细胞命运机制方面发挥了作用。接下来，我们使用Aitchison距离分析了诊断和复发之间原始细胞谱系状态组成的变化。较高的Aitchison距离表明诊断和复发之间原始细胞谱系状态组成存在实质性变化，提示新状态的出现或消失，或现有状态频率的显著变化。当将这些指标与临床元数据相关联时，我们发现高Aitchison距离与改善的总生存率之间存在显著关联，表明无论存在哪些特定的原始细胞谱系状态，诊断和复发之间谱系组成的更大偏差与更有利的结果相关。使用连续Aitchison距离值并调整协变量的Cox比例风险模型进一步支持了这一观察。此外，还发现了与更长复发时间的关联。这与先前显示不稳定原始细胞克隆性与更长无复发生存期相关的基因组研究一致。总之，这些结果表明，由新克隆扩增驱动的复发可能比由持续克隆驱动的复发在某些患者中侵袭性更低。
为了进一步表征原始细胞状态中的基因表达程序，我们在每个患者样本中对其伪批量谱进行了Hallmark基因集的单样本富集分析，并发现炎症反应、细胞周期和氧化磷酸化基因特别富集。利用我们数据集的配对结构，我们还对每个患者诊断和复发之间差异表达的基因进行了富集分析，以鉴定与原始细胞演变相关的转录模式。即，我们观察到在诱导化疗后未达到完全缓解的患者中，由炎症反应、通过NFKB的TNFα信号和TGFβ信号特征驱动的炎症相关通路上调，提示它们在介导原始细胞持久性中的作用。然而，由于这些患者的复发样本是在接受包括FLAG-IDA、NOVE-HiDAC或HCT在内的二线化疗后收集的，我们无法排除这些治疗也在改变这些通路中发挥了作用。为了解决这个问题，我们仅在诊断样本中比较了CR与PR/PRD样本的原始细胞。我们发现这些通路在PR/PRD样本的原始细胞中显示出较低的活性，提示即使在二线化疗治疗前炎症通路活性也相对较低。
3.流式和CITE-seq的联合分析实现了单细胞抗原数量的估计
除了分子异质性，AML中的遗传改变也被证明会改变原始细胞的表面组，这对开发对AML患者具有广泛疗效的免疫疗法具有重要意义。由于不同的治疗方式（如CAR-T疗法和ADC）对靶细胞表面抗原数量有不同的敏感性，在设计这些方式时考虑靶抗原的表面丰度非常重要。使用藻红蛋白偶联的QuantiBRITE微球的定量流式细胞术是一种有效且精确的检测方法，但它一次系统性地检测多种抗原的能力有限。此外，它无法提供单细胞水平的定量信息，阻碍了同一细胞表面共表达的多种抗原的量化。相反，CITE-seq是高通量的，可以为每个细胞产生超过一百种抗原的抗体衍生寡核苷酸标签计数；然而，其读数只能解释为相对值，无法达到相同的定量精度水平。因此，我们首先对已建立的髓系抗原靶点CD33、CLL-1、ADGRE2和CD123进行了重点分析，这些抗原在患者之间和时间点之间的表达显示出显著的异质性。与先前的报道一致，我们观察到在每个抗原的CD45中原始细胞和LSC富集群体中，抗原阳性细胞的中位百分比≥80%。在这些抗原阳性群体中，我们观察到所有患者样本中4种抗原的中位抗原计数≥1,000。此外，这4种抗原的表达读数在流式和CITE-seq之间是一致的，表明它们可以用作桥梁，整合来自每种检测的互补信息。
我们利用机器学习将CD33、CLL-1、CD123和ADGRE2的荧光微球定量计数与其ADT读数在患者样本中关联起来，从而允许将ADT表达值转换为每个细胞抗原数的近似值，如图3B所示。首先，使用QuantiBRITE微球分析创建的标准曲线，将这4种抗原的细胞水平荧光强度转换为抗原数。然后计算每个样本中每种抗原的抗原计数和标准化ADT值的5%分位数，以创建两种检测的分位数映射。接下来，训练了一个人工制品感知的随机森林机器学习模型，以基于每个原始细胞上所有81种抗原的ADT表达来预测抗原数。为了评估模型的稳健性，我们进行了4次训练迭代，每次迭代排除4种抗原中的1种。然后使用每个模型预测被排除抗原在每个原始细胞上的抗原数。从这些输出中，我们发现被排除抗原的平均估计数与流式细胞术测量的平均数一致。这表明在部分抗原特征上训练的模型可以应用于预测未被量化的剩余抗原的表面计数。这种机器学习方法的独特输出使我们能够估计在指定阈值下被任何81种抗原标记的原始细胞的百分比。我们计算了所有样本中共表达CD33和CLL-1的原始细胞百分比，发现全球范围内，57.79%的原始细胞在>1000个抗原/细胞下被两种抗原标记。此外，该资源可用于在多种抗原组合的任何指定阈值下研究表面抗原异质性，为免疫疗法开发提供了宝贵的资源。
ADC和CAR-T疗法是免疫治疗方式，它们依赖于靶表面抗原的充分表达来靶向AML细胞。据报道，ADC需要每个癌细胞1,000-10,000个靶分子，而CAR需要10-100个靶分子才能杀伤。为了独立评估这些说法，我们工程化了AML细胞系克隆，使其表面表达CD33的范围在诊断和复发AML患者样本中观察到的范围内。这些克隆在接受递增浓度的CD33靶向ADC——吉妥珠单抗奥佐米星处理后，进行体外细胞毒性测定。我们发现，具有较高CD33表面表达的克隆对药物表现出更高的敏感性，表现为细胞活力丧失增加，以及相应的半数抑制浓度降低。CD33敲除克隆具有抗性，证实药物疗效是抗原依赖性的。中等表达克隆显示出分级反应，表明治疗敏感性的阈值效应约为3264 ABC。我们还测试了通过同源定向修复介导将CD33构建体插入TRAC基因座生成的CD33靶向CAR-T细胞，其编码4-1BB或CD28共刺激结构域。在1:1效应细胞:靶细胞比率的48小时体外细胞毒性测定中，这些CAR-T细胞分别在2,200和741 ABC的表面表达阈值下诱导了>70%的细胞杀伤。总之，这些结果表明抗原可靶向性取决于治疗方式，并指定了我们用于选择前瞻性靶点的可靶向ABC水平范围。
在AML表面靶点中观察到的异质性，就抗原阳性原始细胞百分比和每个原始细胞的抗原数量而言，以及免疫治疗方式的不同敏感性，表明通过多靶向方法可以实现最佳疗效。基于此框架，我们使用随机森林模型的单细胞抗原数估计，根据所有81种抗原在CD45中原始细胞中的中位抗原数进行排序。由于持续的LSC是复发的根本原因，我们将此分析扩展到CD34⁺CD38⁻ LSC富集细胞群体。为了优先选择具有最高治疗潜力的抗原，我们基于观察到的细胞毒性阈值应用了≥80%抗原阳性和≥1000个抗原/细胞的标准。正如预期，经常研究的AML抗原（包括CD33、CLL-1、CD123和ADGRE2）符合这些标准。其他潜在靶点包括LAIR1、ITGA4、CD44、IL1RAP、CD45、DEC-205、CD34、CD99、CD117、CD47、CD11a、CD9、HLA-DR和CD244，它们在原始细胞上具有高估计抗原数，并且在CD34⁺CD38⁻细胞上也是如此。使用标准化ADT值重复排序发现了相似的趋势。尽管整体表面表达高，但仍然观察到显著的瘤内和瘤间异质性，再次确认多靶向方法可能是根除异质性白血病细胞群体的最佳选择。
选择免疫治疗靶点的一个关键考虑因素是最大限度地减少靶向/非肿瘤毒性，当候选AML抗原也在健康组织上表达时可能发生这种情况。为了解决这个问题，我们分析了来自Tabula Sapiens和GTEx的公共单细胞RNA测序数据，以评估健康组织中不同细胞类型的抗原基因表达。由于这些公共数据集提供的是相对值而非绝对值，我们使用HER2作为比较抗原，代表一个经过临床评估的靶点，显示出治疗功效但在健康重要器官中具有已知的靶向毒性。表达于造血组织的抗原未被排除为潜在靶点，因为新兴方法使用基因工程化的HCT来减轻该区室的毒性。这使我们能够专注于鉴定在AML中高表达但在非造血组织中表达最低的抗原。已建立的AML靶点CD33、CLL-1、IL1RAP、CD45和ADGRE2在包括心脏和肺在内的多个关键组织的基质细胞、上皮细胞和内皮细胞中显示出低表达至无表达。
应用这些抗原阳性和密度阈值，结合健康组织表达过滤器，我们鉴定出四个有前景的候选靶点——LAIR1、ITGA4、DEC-205和CD244——它们在健康的非造血组织中显示出最低表达。对The Cancer Genome Atlas的泛癌分析发现LAIR1、ITGA4和CD244在AML中特异性表达，而DEC-205在多种癌症类型中高表达。在原始细胞群体内，这些抗原中的每一个在27-85%的诊断样本和38-96%的复发样本中符合选择标准。在LSC富集区室中，它们在50-92%的诊断样本和42-89%的复发样本中符合标准。这些发现突显了它们解决bulk白血病原始细胞和治疗耐药LSC的潜力。因此，这四种抗原与已建立的靶点CD33和CLL-1一起被优先考虑进行实验验证，以评估它们单独和组合方法的治疗潜力。
为了验证机器学习模型结果以及4种前瞻性抗原在AML细胞上的表达，我们对10个代表性AML样本的CD45中原始细胞进行了定量流式细胞术。所有四种抗原均强烈表达，中位阳性率≥97%的CD45中原始细胞，每个原始细胞的平均强度≥2,200个抗原。每个前瞻性靶点在LSC富集群体中也具有中位≥91%的阳性细胞和≥1,800个平均每个细胞的抗原。重要的是，每个原始细胞的平均抗原计数与机器学习模型的抗原计数显示出强烈的相关性和一致性，无论抗原或患者样本如何，证明了模型的准确性。使用流式细胞术和机器学习分析它们与CD33的共表达模式，揭示了原始细胞上与CD33的一系列共表达。这些结果进一步强调，一些细胞可能只表达一种抗原或另一种，突显了对OR门控多靶向免疫治疗策略的需求，以增强AML原始细胞的清除。
为了评估这6种抗原在AML细胞上的可靶向性，我们在野生型MOLM-13和工程化的CLL-1表达MOLM-13细胞系中使用GO ADC和二级ADC系统进行了体外细胞毒性测定。对所有6种抗原在这些细胞系上的抗原表达进行了定量。为每个靶抗原生成了敲除细胞系，并用作阴性对照。用GO处理WT MOLM-13细胞导致剂量依赖性细胞毒性，IC50为0.002 nM。使用滴定浓度的初级抗体和恒定浓度的二级ADC靶向CLL-1、LAIR1、ITGA4、DEC-205和CD244，分别产生了0.022、0.047、0.029、0.141和0.171 nM初级抗体的IC50值。在这些IC50浓度下，在敲除细胞系中观察到最小细胞毒性，证明使用GO或二级ADC系统具有特异性细胞毒性。
接下来，为了模拟AML异质性并评估多靶向策略的疗效，我们将MOLM-13细胞系与CD33分别和CLL-1、LAIR1、ITGA4、DEC-205或CD244的敲除细胞以不同比例混合。这些异质性细胞混合物用GO、靶点特异性抗体加二级ADC或两者联合处理，使用从单靶点细胞毒性测定中确定的浓度。在单臂治疗中，靶点依赖性细胞毒性与每个异质性混合物中抗原阳性细胞的比例直接相关，反映了相当大的靶点依赖性。相比之下，联合治疗在所有细胞混合物组成中几乎完全杀死了AML细胞。为了确认特异性，我们使用缺乏CD33和配对靶抗原表达的双敲除MOLM-13细胞系进行了测定。用联合ADC处理这些对照系导致最小反应和杀伤。总的来说，这些原理验证实验的数据证明了同时靶向抗原以对抗AML表面异质性的双ADC策略的优势。
基于先前发现CAR-T细胞比ADC表现出更高的敏感性，我们接下来评估了具有单活性和双活性的第二代CAR构建体对CD33和CLL-1的功效。功能性体外测定表明，CD33和CLL-1的单CAR和双CAR均对WT HL60显示出强效的抗原特异性细胞溶解活性，在HL60双敲除中具有最小的非特异性杀伤。然而，双构建体对仅表达CD33或仅表达CLL-1的HL60单敲除表现出强大的杀伤。相比之下，它们的单CAR对应物未能杀死缺乏靶向抗原的HL60。这些结果突显了双CAR-T细胞通过靶向CD33和CLL-1的逻辑“OR”门机制可以实现强效的细胞溶解活性。该策略有效解决了抗原异质性，并减轻了抗原逃逸突变体的潜在风险。
更多结果和补充图表：doi：10.1016/j.isci.2026.115337
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