脊椎动物骨骼矿化是重大进化创新，但软骨鱼因二次丢失真皮骨而长期缺乏分子机制研究。本研究以猫鲨为模型，选取椎骨矿化启动前（5cm）和启动后（8cm）两个胚胎阶段，通过显微分离前后椎体进行bulk RNA-seq（12个文库，454M reads），并以col2a1标准化剔除软骨体积差异。差异表达分析鉴定到27个显著上调的骨骼候选基因，其中7个均注释为spp2同源物。与硬骨鱼仅有一个spp2拷贝形成鲜明对比，猫鲨基因组在2号染色体上拥有11个spp2旁系同源物。跨越11种软骨鱼的系统发育树揭示4个进化支（spp2.1-2.3/spp2.Like），所有重复事件均发生于软骨鱼共同祖先之后。HCR-FISH和ISH实验确认spp2.3亚家族基因在矿化软骨细胞中与col10a1.4共表达，而spp2.1局限于鳃上皮。蛋白序列分析显示保守的cystatin-like结构域加上大量的SxE磷酸化基序（象鲨单拷贝达21个SxE），暗示spp2重复可能通过增加钙结合能力和BMP2信号调控促进矿化。这项研究揭示了基因串联重复和表达调控域演化作为软骨鱼矿化软骨创新的分子驱动力的范例。
今天给大家解读一篇4月发表在《BMC BIOLOGY》上的题目为“Transcriptomic signature of differentiating catshark cartilage unravels the co-evolution of the Spp2 gene family with skeletal mineralisation in cartilaginous fish.”的文章。研究以小型斑猫鲨为模型，采用批量RNA测序技术，对比脊椎矿化开始前后的胚胎软骨转录组，鉴定出有颌脊椎动物共有的软骨细胞早期分化和软骨合成相关基因集。进一步发现，在猫鲨矿化软骨细胞中，仅极少数之前在哺乳动物骨骼发生中鉴定的基因表达上调，其中特别关注了Spp2基因家族。通过系统发育分析和表达研究，证明软骨鱼类拥有多个Spp2基因拷贝且表达部位各异，而硬骨鱼类中仅为单一基因，从而表明两者独立进化出不同的软骨矿化策略。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《不同鲨鱼软骨分化过程中的转录组特征揭示了Spp2基因家族与软骨鱼类骨骼矿化共同进化的机制》Transcriptomic signature of differentiating catshark cartilage unravels the co-evolution of the Spp2 gene family with skeletal mineralisation in cartilaginous fish
发表期刊：BMC BIOLOGY
影响因子：4.5
研究背景：
骨骼矿化通过控制磷酸钙沉淀实现，是早期脊椎动物的重要进化创新。这一过程在硬骨物种中已广泛研究，但在缺乏软骨内骨的软骨鱼类中了解甚少。因此，本研究以小型斑猫鲨为模型，旨在探讨软骨分化及后续矿化的遗传基础。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
选取胚胎发育晚期两个关键阶段：一个在脊椎矿化开始之前，另一个在开始之后。利用批量RNA测序方法，鉴定表征软骨细胞早期分化和软骨合成的基因集。比较这些基因在猫鲨矿化软骨细胞中的表达与已知哺乳动物骨骼发生基因的异同，并重点分析Spp2基因家族。通过系统发育分析和基因表达研究，阐明软骨鱼类与硬骨鱼类在软骨矿化机制上的进化关系。
研究亮点：
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首次在缺乏软骨内骨的软骨鱼类中系统鉴定与软骨分化及矿化相关的基因集，发现其中仅极少数与哺乳动物骨骼发生中已知的基因重叠。
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聚焦Spp2基因家族，发现软骨鱼类拥有多个基因拷贝且表达部位各异，而硬骨鱼类中Spp2为单一且研究较少的基因。
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通过系统发育分析和表达研究，证明尽管软骨鱼类和硬骨鱼类可能继承了共同有颌脊椎动物祖先的分子组分，但两者独立进化出了不同的软骨矿化策略。
研究结果：
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鉴定出一组在有颌脊椎动物中共享的、表征软骨细胞早期分化和软骨合成的基因。
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在猫鲨矿化软骨细胞中，仅有极少数之前于哺乳动物骨骼发生中识别的基因表现上调。
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与硬骨鱼类中Spp2为单一且研究较少的基因不同，软骨鱼类拥有多个Spp2基因拷贝，且表达部位各异。
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尽管可能从最后的有颌脊椎动物祖先继承了共享的分子组分，软骨鱼类和硬骨鱼类独立进化出了不同的软骨矿化策略。
研究总结：
本研究突出了骨骼发育机制的多样性，并强调了软骨鱼类在拓宽我们对脊椎动物矿化进化理解方面的重要性。通过对比保守特征和谱系特有特征，该研究为塑造现代脊椎动物骨骼结构的独立轨迹提供了新见解。Spp2基因家族在软骨鱼类中的扩增和差异化表达，可能代表了软骨鱼类特有的矿化调控途径，与硬骨鱼类的单一Spp2基因形成鲜明对比，共同揭示了矿化策略的趋异进化。
结果译文：
为识别包含矿化过程的软骨分化相关基因，我们在小斑点猫鲨脊椎矿化时间前后选取5cm和8cm总长两个胚胎阶段的3个个体，在脊柱的两个区域取样横截面（"前部"，位于胸鳍水平；"后部"，位于腹鳍后部），对共12个样本进行bulk RNA提取和测序（图1）。
组织占比差异是bulk RNA转录组学差异表达分析中最突出的问题，考虑到col2a1是软骨细胞在各取样阶段均强烈表达的标志物，我们比较了不同文库中col2a1表达丰度（TPM值）。col2a1转录本在不同文库中的丰度存在差异（在1到10的量级上，见表S1中的XM_038786372.1）。因此我们生成了col2a1标准化计数数据集，以最小化因样本间软骨体积差异而导致的表达变化。差异表达分析（DEseq）对原始计数和col2a1标准化数据集分别进行。该分析从原始数据集中筛选出3,076个在较大胚胎（8cm期）中上调的基因（Log2FC≥1；padj<0.05），以及从col2a1标准化数据集中获得的2,998个上调基因（两项分析共享2,972个）。原始与col2a1标准化数据集的高度一致表明三次重复分析对软骨比例变异具有良好的稳健性。后续分析仅基于col2a1标准化的数据集进行（图2）。
基因本体（GO）词条过表达分析揭示这些上调基因在肌肉或神经组织发育相关生物功能中显著富集（补充文件2：表S5–S6），表明脊椎周围组织（如肌肉、血管或神经组织）的显著参与（图1）。为规避此问题，我们通过设置"骨骼基因"参考数据集添加过滤步骤。我们应用涵盖31种组织的bulk RNAseq数据集，选择在骨组织中表达正向偏向的基因（椎骨和Meckel软骨文库中的Z-score ≥ 1），并在主要"污染"组织（肌肉：Z-score ≤ 0）中负向偏向。此分析生成654个转录本列表，其中398个在猫鲨基因组中有注释（补充文件2：表S7），GO词条过表达指向软骨和骨骼发育相关的生物过程（补充文件2：表S8）。DEseq与骨骼候选基因取交集（图2）后，产生了65、63、54和42个精简基因列表，分别基于：原始数据集、col2a1标准化数据集（所有椎骨合并）、col2a1标准化前部椎骨数据集和col2a1标准化后部椎骨数据集（见补充文件3：表S9）。
这些结果基因中许多编码非编码RNA，或编码与任何脊椎动物蛋白均无相似性的预测蛋白序列。那些在先前猫鲨研究中无法与参考基因组比对的Cluster-序列常存在此类情况：这些序列质量通常较低，无法排除组装假象，因此不再进一步分析。在col2a1标准化数据集分析中至少在两项中显著上调的剩余37个基因列表中（表1），我们同时排除了在胚胎椎骨中表达水平极低的7个基因和3个注释为自噬或凋亡功能的基因。在最终列表的27个基因中，有2个此前已被研究——bgp表达于矿化软骨周围的软骨膜细胞中，以及scpp在矿化牙齿和鳞片中表达。
为鉴定其他上调基因的表达细胞，我们对那些在胚胎RNAseq和成体RNAseq数据中均具有较高表达水平的基因进行了原位杂交。13个被检测基因中有8个在前部椎骨中显著上调而后部样本中未达显著。这一结果与椎骨矿化是逐步过程、胸椎区域早于盆后区域的观察一致。
对矿化前部椎骨横切片的原位杂交显示，三个注释为clec3a、otos以及cluster-18614.1的基因在所有软骨组织的软骨细胞中表达，与col2a1的表达相当（图3-4）。系统发育重建确认了XP_038662176.1与哺乳动物Clec3a编码基因的1对1直系同源性（补充文件4：图S1），提示Clec3a在成熟软骨细胞稳态中的保守功能。系统发育重建鉴定cluster-18614.1为tgfb2B编码基因，即有颌类中的两个Tgfβ2编码基因之一。这也支持两种Tgfβ2蛋白在软骨细胞稳态中古老保守性的观点。包含XP_038672192.1的系统发育重建确认其注释为哺乳动物Otospiralin编码基因的1对1直系同源物（补充文件6：图S3），尽管存在第二个有颌类旁系同源物。在软骨细胞中观察到otos的表达是出乎意料的，因为哺乳动物Otospiralin蛋白的功能仅限于内耳韧带。斑马鱼的一个otospiralin基因被发现在脊索细胞中表达，进一步提示其在结缔/骨骼组织发育中的潜在祖先功能。最后，其他被检测的基因在神经管中表达（未鉴定的XM_038784999.1、coch、ctgf和cstl；图4），表明我们的数据集同时包含了保守的中枢神经系统基因。在被检测的基因中，除Spp2相关序列外，无一基因在矿化软骨细胞中显示特异性表达（图3及下文）。
在"col2a1标准化"差异表达分析中，我们还筛选出178个在椎骨矿化期间下调的基因。其中74个具有胞外基质发育中的注释功能（补充文件7：表S10），包括软骨细胞或软骨膜主要结构蛋白：纤维性和非纤维性胶原（许多亚型）、胶原合成与组装蛋白。软骨鱼X型胶原编码基因之一（此前鉴定为col10a1.4）在两时间点之间表现为下调，而此前研究表明它由早期矿化软骨细胞表达。该观察提示此基因表达出现在软骨细胞分化为矿化软骨细胞上游，随后在分化矿化软骨细胞中下调，尽管8cm椎骨中仍有强烈表达（图3E）。col10a1.4表达表观下调也可能源于8cm椎骨中增殖软骨比例更高的影响。下调基因中还包括多种蛋白聚糖，突出的有Agrecan、许多SLRP家族基因和数个参与蛋白聚糖合成与组装的基因。这些基因表达可能表征早期软骨细胞和软骨膜细胞在胞外基质矿化前的转录组特征，尤其是若干已知介导软骨细胞分化甚至成骨细胞分化的转录因子和其他蛋白。
差异表达结果的一个显著特征是鉴定到7个不同基因，均注释为spp2同源物（分泌型磷蛋白2），并且均在矿化过程中强至中度上调并在包围矿化基质的软骨细胞中表达（图3和表1）。我们首先确认这7个基因全部位于猫鲨2号染色体的单基因组位点上，且此位点包含的该基因家族编码序列超过7个。对猫鲨基因组的BLAST检索共获得11个序列，均位于2号染色体上nme9和vps8注释位点的邻近区域（补充文件8：图S4）。第12个spp2相关基因发现于9号染色体。然后将这些猫鲨序列对硬骨脊椎动物基因组进行BLAST检索，仅鉴定出一个相似序列即spp2，且在斑点雀鳝中同样与nme9和vps8共线性，但在小鼠中仅与位于猫鲨spp2基因簇另一侧的基因（sh3bp4和arl4c，见图5）共线性。对其他软骨鱼基因组的BLAST检索获得了数量不等的假定spp2重复序列，它们同样被分配到sh3bp4/arl4c/nme9/vps8/cops8位点上，尽管大白鲨位点上出现了一些表观染色体重排。与此对比，象鲨仅拥有一个拷贝（图5）。
相对于osteychthyan组的序列，spp2系统发育将软骨鱼序列区分为四个主要支系，本文称为spp2.1、spp2.2、spp2.3和spp2.Like（图6）。spp2.2和spp2.3支系为稳健的姐妹群，但它们与spp2.1或spp2.Like支系之间的关系缺乏良好支持。spp2.3支系包含象鲨中的唯一spp2拷贝，提示产生四个支系的重复事件早于现存软骨鱼类的最后一次共同祖先，且象鲨谱系中发生了三次次级丢失。祖先的spp2.3基因在所有受检的软骨鱼中进一步经历了多次附加的串联重复，各物种间重复速率各异。spp2.3支系中同一物种序列的聚类性质表明，这些是近期发生的快速重复，并在软骨鱼各自谱系中独立发生，从而导致高度序列相似性。Scyliorhinus canicula的7个spp2.3重复拷贝被命名为spp2.3s1-7：DEseq分析中它们均在矿化椎骨中上调，尽管spp2.3s3仅在后部椎骨中显著上调（表1）。由于spp2.3和spp2.2转录本的序列相似性，我们的原位杂交RNA探针对单一基因并非严格特异（补充文件9：表S11-S12和补充文件10：比对S1）。我们首先考虑通用spp2探针能够结合大多数spp2.3基因，其次也会与spp2.2发生交叉杂交。用此探针进行的RNA原位杂交显示，至少这些基因中的一个亚群在猫鲨胚胎的神经弓和椎体矿化软骨细胞中表达（图7）。该表达模式与特异性更强的探针spp2.3s7获得的结果相当（与spp2.3s2和s6相似度>90%，与spp2.3s3/4/5相似度>80%，图3、8）。spp2.1的特异性表达发现于鳃上皮而非骨骼组织中（图7）。这些表达模式与成体RNAseq数据一致——所有spp2.2和spp2.3基因在椎骨/Meckel软骨/软骨颅中TPM值高，spp2.1在鳃中TPM值高（表2）。然而，两个spp2.Like的低表达水平使我们无法检测到牙齿和鳞片中的阳性染色（表2）。为比较spp2.3s7与col2a1和col10a1.4在不同细胞群体中的表达，我们设计了另一组探针用于HCR™ Gold RNA-FISH实验，并结合8cm胚胎中col2a1和col10a1.4的表达进行检测（图8）。检测到的信号支持此spp2.3s7基因在矿化组织软骨细胞中的共表达——不仅在神经弓核心部位，也在椎体纤维鞘周围区域表达（图8 F-I）。同时还显示了spp2.3s7与col2a1在一些紧邻矿化位点外侧的软骨细胞中的共表达（图8 D-G），提示存在一个中间分化阶段：软骨细胞在此阶段仍表达col2a1但并不表达col10a1.4。
人类和其他硬骨鱼的spp2蛋白序列包含一个信号肽、一个含四个保守半胱氨酸的cystatin样结构域、一系列限定了一种"丝氨酸富集区"的丝氨酸（包括假定的磷酸化位点），以及一个主要在肉鳍动物和七鳃鳗蛋白中可检测到的C端精氨酸富集区域（图9）。猫鲨在spp2.1、spp2.2和spp2.3支系中的序列同样具有cystatin样结构域，并以在丝氨酸延伸段之外的C末端的SxE基序大量积累为特征。最极端的例子见于象鲨唯一的spp2.3，其拥有21个SxE基序但缺乏丝氨酸延伸段（图9）。富含精氨酸的C端区域仅在猫鲨spp2.1和spp2.L2序列以及象鲨序列中明显可检测。spp2.Like序列显示出主要趋异——spp2.L1缺乏可识别的cystatin样结构域，spp2.L2则在cystatin样结构域和丝氨酸富集区之间插入了一段重复序列。
更多结果和补充图表：doi：10.1186/s12915-026-02593-9
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