模拟人脑早期发育和感觉器官间相互作用是类器官技术的重大挑战。本研究建立了标准化的大脑类器官和含视泡脑类器官（OVB-organoids）培养方案，并通过免疫荧光、转录组学（DNBSEQ平台）和透射电镜对培养第30天的两种模型进行多尺度比较。OVB-类器官采用TGF-β抑制剂SB431542和BMP抑制剂Dorsomorphin双信号阻断策略，成功实现FOXG1（端脑标志物，53.86%±5.58%阳性细胞）和VSX2（视杯标志物，4.18%±1.04%）的共表达，证实端脑与视杯双区室化结构形成。转录组分析鉴定出4549个差异表达基因，KEGG富集揭示OVB-类器官上调基因集中于谷氨酸能突触、GABA突触、长时程增强和神经营养信号通路，而下调基因富集于补体级联、胆固醇代谢和ECM-受体互作。TEM证实第20天形成功能性突触，第30天出现髓鞘样结构。GSVA分析进一步显示OVB-类器官在视觉感知、成像是是、视觉学习等通路显著激活，RT-qPCR验证CHRNB2、SIX3等6个视觉相关基因表达具有转录组一致的梯度差异。这项研究为眼-脑协调发育机制研究和视网膜疾病建模提供了坚实的模型选择依据。
今天给大家解读一篇4月发表在《Cells》上的题目为“Multiscale Comparative Analyses of OVB-Organoids and Cerebral Organoids.”的文章。该研究针对现有单类器官培养系统无法模拟胚胎发生中视泡-脑等器官间相互作用的问题，建立了标准化的大脑类器官和含视泡的脑类器官（OVB-organoids）。通过免疫荧光和转录组学进行多尺度比较分析，发现两者在细胞组成、结构、功能和发展上存在关键差异，OVB类器官能更好地模拟早期视网膜发育及视觉相关结构/功能，且具有特定VSX2表达和一致的转录组谱。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《OVB类脑器官与大脑类脑器官的多尺度比较分析》Multiscale Comparative Analyses of OVB-Organoids and Cerebral Organoids
发表期刊：Cells
影响因子：5.2
研究背景：
类器官技术对于研究人类大脑发育至关重要，但现有单类器官培养系统无法模拟胚胎发生过程中器官间的相互作用（例如视泡-脑）。因此，需要建立更全面的体外早期神经发育模型。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
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建立标准化的大脑类器官和含视泡的脑类器官（OVB-organoids）培养方案。
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利用免疫荧光和转录组学对两种模型进行多尺度比较分析。
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研究亮点：
建立了标准化的大脑类器官和OVB类器官培养方案，并利用免疫荧光和转录组学进行多尺度比较分析，揭示了两种模型在细胞组成、结构、功能和发展上的关键差异。
研究结果：
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两种模型在细胞组成、结构、功能和发展方面存在关键差异。
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OVB类器官更能模拟早期视网膜发育及视觉相关的结构和功能，表现为特定VSX2表达和一致的转录组谱。
研究总结：
OVB类器官是早期神经发育的改进模型，为探索眼-脑协同发育机制提供了可靠基础，在发育生物学、疾病研究和个性化医疗中具有广泛的应用前景。
结果译文：
通过系统性的时间序列培养和形态学动态追踪（图1），本研究初步揭示了来源于hiPSCs的大脑类器官和OVB-类器官在发育动力学和结构特征方面的差异。虽然两者共享共同的细胞起源，但关键生长因子和信号通路抑制剂的协调调控引导hiPSC朝向不同谱系特化。
在大脑类器官培养所用培养基中，肝素（1μg/mL）结合并稳定FGF等生长因子，从而促进神经前体细胞增殖和神经囊泡形成。此外，抗坏血酸（维生素C，1%（v/v））提供抗氧化保护并增强神经元成熟和突触功能。相比之下，OVB-类器官培养的核心调控策略依赖于SB431542（TGF-β抑制剂，2.5–5μM）和Dorsomorphin（BMP抑制剂，0.5μM）的双重信号阻断。具体而言，SB431542抑制TGF-β/Smad通路以防止间充质分化并促进神经外胚层命运，而Dorsomorphin抑制BMP信号以进一步锁定视网膜色素上皮和神经视网膜谱系。
维生素A作为神经发育的关键调控因子，在两种类型类器官的培养中均有使用。它通过激活视黄酸受体（RAR/RXR）来调控基因表达，从而影响神经前体细胞的区域化、分化和形态发生。在类器官培养中，早期阶段省略维生素A可防止过早区域化，允许由内源性信号（如FGF和WNT）驱动脑区结构的自发形成。相反，在后期阶段添加维生素A则促进特定脑区（例如皮层、基底节和海马）的进一步区域化以及神经元亚型（如谷氨酸能和GABA能神经元）的分化。
在培养早期阶段，两种类器官类型均表现出细胞聚集并初步形成3D结构。在大脑类器官中，将神经外胚层组织转移到Matrigel液滴中促进神经上皮芽的形成和扩张，这些芽逐渐发展成典型的神经玫瑰花环结构。相比之下，OVB-类器官在含有Matrigel的液体环境中悬浮培养；这种设置有利于在3D空间中进行自我组装，导致形成具有更复杂结构的类器官。
尽管两种类器官均来源于hiPSC，不同的培养基调控机制使它们能够采用独特的策略并在模拟不同发育过程中实现特定目标。通过比较这两种培养方法，我们可以更深入地了解在器官（如脑和视网膜）发育过程中细胞分化、组织形态发生和功能成熟的复杂机制。这不仅增强了我们对类器官技术在模拟人类器官发育方面的潜力和局限性的理解，也为未来疾病建模和再生医学研究提供有价值的参考。
利用对特定标志物的免疫荧光染色，我们阐明了hiPSC来源的大脑类器官和OVB-类器官在细胞组成和空间分布方面的表型差异。这进一步验证了不同调控策略在引导hiPSC谱系特化中的精准作用，为探究这两种类器官类型的功能特异性奠定了表型基础。两组第30天的类器官被用作研究对象以表征类器官的发育状态，并对与细胞增殖、神经干细胞（NSC）维持和神经元分化相关的关键标志物进行了免疫荧光染色。
对于培养至第30天的大脑类器官，进行了Ki67和SOX2的共染色（图2）。该分析揭示了Ki67⁺细胞（增殖标志物）和SOX2⁺细胞（核心NSC转录因子）之间的重叠，表明在类器官内持续存在大量增殖的NSC。这些细胞构成了后续分化的持续来源。通过Nestin/SOX2共染色NSC标志物，我们观察到两种标志物的显著共表达。此外，细胞围绕中央腔排列，形成类似神经上皮或放射状胶质细胞的极性结构。这提示该系统含有丰富的NSC群体并展现出极性神经上皮样结构，符合NSC增殖和维持的特征。神经元分化过程的染色分析显示PAX6（早期神经分化和皮层发育的关键因子）广泛分布，表明早期神经命运决定和类皮层结构的发育已经启动。同时，成熟神经元标志物MAP2（红色）展示特异性染色，表明某些细胞已经分化为成熟神经元。大脑类器官处于一个动态发育阶段，覆盖了从NSC维持、定向分化到早期神经元成熟的过程。这些大脑类器官展示了从NSC增殖到神经元成熟的连续发育过程，展现进一步成熟为复杂脑结构和功能的潜力。
使用免疫荧光染色检测关键标志物基因的表达以研究培养至第30天的OVB-类器官的发育特征（图3和S1）。Ki67/SOX2共染色揭示了两种标志物的广泛表达，表明活跃的细胞增殖，以及细胞要么保留多能性要么处于神经发育的早期阶段。Nestin表达确认了NSC的存在，而MAP2表达表明成熟神经元已初步形成。这两种标志物的联合分析提示OVB-类器官正处于NSC向成熟神经元分化的阶段。FOXG1，端脑发育的关键调控因子，展现了荧光表达，证明端脑发育相关程序已经启动。此外，VSX2（视杯发育的关键标志物基因）被表达，指示朝向视杯结构形成的发育趋势。值得注意的是，FOXG1和VSX2在OVB-类器官内的不完全重叠反映了该系统具有多结构发育特性。结果表明OVB-类器官目前处于过渡发育阶段，从细胞增殖和多能性维持向特定神经结构（如端脑和视杯）的分化进展。广泛的Ki67表达为支持类器官生长和后续分化提供了充足的细胞来源。SOX2持续高表达为类器官进一步分化为特定神经细胞谱系奠定了坚实基础。Nestin的表达作为直接证据确证了类器官内NSC的存在，而MAP2的微弱表达表明细胞向成熟神经元的分化过程尚未完全实现。FOXG1和VSX2的共存表达突显了OVB-类器官在重现体内大脑发育复杂性方面的独特优势。该特性使其成为研究控制眼和脑协调发育的分子和细胞机制的优越体外模型。此外，OVB-类器官系统是全面研究协调眼-脑发育过程的调控网络的强大实验手段。
本研究使用ImageJ软件对两种类型类器官的免疫荧光染色结果进行了半定量分析（图4A-D）。结果表明，在四个检测基因（Ki67、SOX2、Nestin和MAP2）的表达水平上，两种类器官之间无显著差异，提示在此发育阶段的基因表达模式高度相似，表明发育过程相对一致。此外，对FOXG1和VSX2阳性细胞比例进行了定量，在OVB-类器官中FOXG1⁺细胞占53.86%±5.58%，而VSX2⁺细胞占4.18%±1.04%（图4E）。
综合来看，免疫荧光染色结果表明，尽管共享共同的细胞起源，这两种类器官类型展现出独特的发育特征和轨迹。每种类型都具有独特的研究价值，为神经发育和相关病理学提供了互补的见解。
在基因表达水平上对OVB-类器官和大脑类器官进行了全面的转录组分析，以解析两种类器官类型之间在发育通路、细胞组成和功能方面的潜在显著差异。
首先，Venn图（图5A）可视化共同和特异性基因，其代表16,987个共表达基因，而非重叠区域显示OVB-类器官和大脑类器官中分别有338和951个特异性表达基因。这鉴定了两种类器官之间基因表达的相似性和差异性，反映其在生物功能或发育阶段上的潜在差异。对所有两种类器官的基因进行了差异表达分析（|log2FC|>1且Qvalue<=0.05）。相对于大脑类器官，OVB-类器官中总共有1625个基因上调和2924个基因下调（图5B,C）。该分析不仅展示基因表达变化的统计显著性，还直观展现其变化幅度，为后续鉴定关键差异表达基因提供了关键信息。使用热图展示了差异基因的表达模式（图5D）。由于这些基因可能参与特定生物过程或信号通路，进行富集分析以在更高维度评估差异基因的生物学意义。
KEGG富集分析（图6A）揭示差异表达基因显著富集于与细胞周期、增殖和信号转导相关的通路。这些通路是器官形态发生和有序细胞生长的基础，提示它们可能参与视杯的形成、发育和信号转导。进一步的KEGG通路分类（图6B）显示差异表达基因在细胞过程类别中的细胞生长与死亡通路以及运输与分解代谢通路中显著富集。这些通路在调控细胞生长、分化以及视杯结构的形成和发育方面发挥关键作用。
在GO细胞组成富集分析中（图6C），差异表达基因显著富集于与细胞分裂、细胞周期、RNA剪接和蛋白运输相关的通路。对于GO分子功能富集分析（图6D），两种类器官之间脑区和视杯发育的差异反映在钙黏蛋白结合所代表的结合功能中。这些功能通路参与了关键分子相互作用的调控，可能是类器官发育过程中观察到的表型差异的基础。在GO生物过程富集分析中（图6E），在包括细胞核、细胞质和染色体的通路中检测到显著富集。这些生物过程对视网膜细胞及其相关结构的分化、发育和功能建立至关重要。在图6F中，使用KEGG富集分析对上调和下调基因进行了分析。与大脑类器官相比，OVB-类器官中上调的基因显著富集于多条神经发育和突触功能通路（如谷氨酸能突触、GABA突触和长时程增强）。相比之下，下调的基因主要富集于免疫炎症通路（如补体和凝血级联）以及代谢/粘附通路（如胆固醇代谢、ECM-受体相互作用）。通路的具体信息见表S6和S7。
如图7所示，在第20天的OVB-类器官中已出现少量突触和突触小泡（红箭头标示）。突触前后膜结构致密且清晰，突触小泡在突触前膜区域以环形或卵圆形聚集。这表明神经元在发育上已经趋于成熟，神经元之间已经开始形成功能性突触连接，提示所构建的脑类器官神经网络已经进入了功能成熟阶段。在第30天的OVB-类器官中，可观察到髓鞘样结构（白箭头标示），提示类器官内已经发生了胶质细胞的分化和成熟，并且围绕神经轴突开始形成髓鞘。髓鞘结构的出现表明这些OVB-类器官具备良好的神经发育微环境，能够支持神经元成熟、突触形成和髓鞘化的同步进程，从而实现神经元与胶质细胞的协调发育，为神经功能验证提供了重要的形态学基础。
基因集变异分析（图8A）证明OVB-类器官在DNA复制、神经营养信号通路和细胞周期方面表现出更强的活性，表明OVB-类器官在生物合成和细胞增殖方面更为活跃。相比之下，大脑类器官在与代谢相关通路（例如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）和信号转导通路（例如RIG-I样受体信号通路）方面表现出高活性。
视觉通路富集分析（图8B）揭示了在OVB-类器官中与视杯形成、视神经结构形成和视觉学习相关的通路激活。这提示OVB-类器官可能具有发育为视觉相关神经结构（如视杯、视神经）的潜能。
选择六个视觉相关差异基因通过RT-qPCR进行了验证（图8C）。这些基因中的大多数表现出与转录组数据一致的表达模式。
总之，OVB-类器官在模拟早期视网膜发育、构建视杯和视神经结构、形成视觉相关神经回路以及实现视觉功能方面展示出与大脑类器官的显著差异。这些特性使OVB-类器官成为研究视觉疾病和再生医学的重要实验模型。
更多结果和补充图表：doi： 10.3390/cells15080703
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