衰老如何导致肠道屏障“渗漏”和代谢功能下降？本研究从肠道腔内外泌体（LFEs）这一全新角度给出了答案。研究团队从年轻和老年小鼠粪便中分离纯化LFEs，并运用蛋白质组学、miRNA组学及16S rRNA测序的多组学联合生信分析，首次系统描绘了LFEs货物随年龄和性别的重塑图谱。结果令人震惊：老年小鼠的LFEs富含与胰岛素抵抗和肠道屏障破坏相关的蛋白质（如Annexin A2上调、Reg3g下调）和miRNAs（如miR-194-5p、let-7f-5p）。更关键的是，将这些“老化”的LFEs灌胃给年轻小鼠后，不仅成功诱导了肠道通透性增加和胰岛素敏感性受损，还改变了受体肠道菌群的组成。通过mixOmics框架的DIABLO多组学整合分析，研究揭示了LFE中宿主蛋白、细菌蛋白和miRNA之间的年龄及性别依赖性协同调控网络。这一发现不仅确立了LFEs作为衰老相关肠道-微生物-宿主通讯的关键信使，更为干预衰老相关代谢衰退提供了基于外泌体的全新治疗策略。
今天给大家解读一篇4月发表在《Aging Cell》上的题目为“Gut Luminal Exosomes in Young and Old Mice: Multi-Omic Characteristics and Regulation of Gut Permeability.”的文章。该研究旨在探究肠道腔内外泌体（LFEs）在年龄相关的代谢功能障碍中的作用。研究者从年轻和年老的雄性和雌性小鼠中分离出LFEs，并进行表征。通过体内外实验评估LFEs对肠道屏障完整性和系统代谢的影响，并利用多组学技术（蛋白质组学、miRNA测序及16S rRNA测序）分析其分子机制。结果发现，年老鼠的LFEs携带不同的蛋白质和miRNA，能够破坏肠道屏障、改变微生物组，并在年轻受体小鼠中诱导胰岛素抵抗，而年轻小鼠的LFEs则具有相反的保护作用。本研究鉴定LFEs为一种年龄依赖性的肠道微生物-宿主通讯的功能性媒介。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《年轻和年老小鼠肠道腔内外泌体：多组学特征及对肠道通透性的调控》Gut Luminal Exosomes in Young and Old Mice: Multi-Omic Characteristics and Regulation of Gut Permeability
发表期刊：Aging Cell
影响因子：7.1
研究背景：
- 衰老与肠道健康
衰老是多方面的生理过程，伴随着免疫功能下降、慢性炎症和肠道微生物组失调（菌群失调）。这些变化被认为是多种年龄相关疾病（如2型糖尿病、心血管疾病）的重要风险因素。
- 肠道微生物的作用
已知肠道微生物组随年龄变化，影响宿主代谢和免疫。通过粪菌移植（FMT）等方法可以传递与代谢健康相关的有益或有害效应，改变肠道通透性。
- 细胞外囊泡（EVs）
EVs（包括外泌体）是细胞释放的纳米级颗粒，在细胞间通讯中发挥关键作用。肠道微生物和宿主细胞都会释放EVs，它们携带蛋白质、核酸等“货物”，能够调节肠道微环境和宿主健康。
- 研究空白
尽管FMT显示了微生物群与宿主功能之间的联系，但粪便中哪种具体的活性成分（如外泌体）在介导这些衰老相关效应中起主要作用尚不明确。特别是肠道腔内的外泌体（LFEs）作为年龄相关变化的媒介，其角色未被充分探索。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 假设提出
研究假设衰老会改变肠道腔内外泌体（LFEs）的分子货物，从而损害肠道屏障完整性和系统代谢调节。
- 模型建立
选取年轻（3月龄）和年老（24月龄）的雄性和雌性小鼠，构建年龄和性别的研究模型。
- LFE分离与表征
从不同组别小鼠的粪便中分离并纯化LFEs，通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和流式细胞术验证其形态、大小和标志物。
- 功能验证（因果性）
- 体外
将不同来源的LFEs加到小肠上皮细胞单层上，利用ECIS和3D微流控芯片系统，实时监测其对屏障电阻和通透性的影响。
- 体内（基础状态）
直接测量不同年龄/性别小鼠的肠道通透性（FITC-葡聚糖实验）。
- 体内（因果移植）
将年老小鼠的LFEs通过灌胃方式持续喂给年轻受体小鼠8周，然后检测受体小鼠的葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT），以及肠道微生物组的变化。
- 分子机制探索（多组学）
- 蛋白质组学
对LFEs中的宿主来源和细菌来源的蛋白质进行质谱分析，鉴定差异表达蛋白（DEPs）。
- miRNA测序
对LFEs中的小RNA进行测序，鉴定差异表达的miRNAs（DEMs）。
- 整合分析
利用多组学整合方法（mixOmics包），分析蛋白质与miRNA的关联网络，并将其与功能表型联系起来。
研究亮点：
- 功能性验证与因果推断
研究不仅描述了衰老过程中LFEs分子组成的差异，更重要的是通过灌胃移植实验，将年老小鼠的LFEs喂给年轻小鼠，直接证明了衰老的LFEs足以在健康个体中诱导肠道屏障损伤和代谢紊乱，建立了因果关系。
- 多模态与多组学整合
研究综合运用了体外细胞实验（ECIS、3D微流控芯片）、体内动物模型（FITC-葡聚糖渗透实验、GTT/ITT）以及多组学分析（16S rRNA测序、宿主和细菌蛋白质组学、miRNA测序），对LFEs的功能和分子机制进行了全面系统的解析。
- 年龄与性别的双重考量
研究分别分析了雄性和雌性小鼠，揭示了LFEs在衰老过程中变化的性别差异。例如，年老雄鼠的肠道屏障损伤和胰岛素抵抗现象比年老雌鼠更为严重，表明性别是调节衰老相关功能衰退的一个重要变量。
- 微生物组与宿主对话的新介质
研究将LFEs定位为连接肠道微生物组变化与宿主生理功能衰退的新型功能媒介，超越了既往仅关注肠道菌群本身或宿主血浆因子的研究范畴。
研究结果：
- LFE特征和摄取
所有组别LFEs的形态、大小范围和CD63标志物表达一致，细胞摄取效率无显著差异。这表明随后的功能差异主要由LFE的“货物”内容而非数量或摄取能力决定。
- 肠道屏障功能
- 体外
来自年老小鼠（特别是年老雄鼠）的LFEs显著降低了小肠上皮细胞的电阻抗，增加了FITC-葡聚糖的渗透，表明屏障功能受损。
- 体内
年老小鼠的基线肠道通透性显著高于年轻小鼠，其中年老雄鼠（OM）的通透性最高，几乎是年轻雄鼠（YM）的4倍。
- 代谢功能
-
将年老小鼠的LFEs移植给年轻小鼠后，受体小鼠的葡萄糖耐量受损（GTT AUC增高）和胰岛素敏感性降低（ITT AUC增高），而移植年轻小鼠的LFEs则无此效应。
- 肠道微生物组重塑
移植年老小鼠的LFEs后，年轻受体小鼠的肠道微生物组组成发生显著变化，如特定菌群（如Dubosiella, Bifidobacterium）丰度增加。
- 多组学分子图谱
- 蛋白质组
发现数百种差异表达蛋白。年老小鼠LFEs中与免疫（如Jchain下调）、代谢与消化（如Klk1, Prss2下调）、蛋白降解（如蛋白酶体亚基上调）和心血管功能（肾素-血管紧张素系统）相关的通路发生变化。细菌蛋白也显示出与能量代谢和翻译活性相关的年龄和性别差异。
- miRNA
鉴定出多个年龄和性别相关的差异表达miRNA，其靶基因富集于MAPK、PI3K-Akt、mTOR、自噬等与细胞生长、存活、应激和衰老相关的信号通路。
- 整合分析
整合蛋白质组与miRNA组数据，揭示了年龄和性别特异性分子网络的变化，表明LFEs携带的 “分子指令” 是协调且复杂的。
研究总结：
主要结论：
-
衰老（以及性别）显著改变肠道腔内外泌体（LFEs）的蛋白质和miRNA分子货物，这些货物部分来源于宿主，部分来源于肠道微生物群。
-
LFEs具有生物活性，能够作为功能性载体，在个体间传递与衰老相关的表型。具体而言，来自年老小鼠的LFEs足以直接加剧肠道屏障功能障碍、诱导胰岛素抵抗和重塑肠道微生物群落。
-
这些发现将肠道腔内外泌体确立为一种新的、被低估的年龄依赖性微生物-宿主通讯媒介，是连接肠道微环境变化与系统性衰老表型的关键桥梁。
讨论与展望：
- 机制阐述
研究提出的一个工作模型是，衰老导致肠道菌群失调，进而改变了由宿主和微生物共同产生的LFEs的分子货物（如特定蛋白质和miRNA）。这些“老化”的LFEs随后作用于肠道上皮细胞，通过影响MAPK、PI3K-Akt等信号通路，破坏细胞连接和维持屏障功能的机制，从而增加肠道通透性（“肠漏”），并引发全身性的代谢紊乱。
- 干预新靶点
鉴于LFEs在传递衰老信号中的核心作用，靶向LFE介导的信号通路（例如，通过年轻时补充“年轻”的LFEs或阻断“年老的”LFEs的有害效应），可能成为缓解与年龄相关的肠道和代谢功能障碍、促进健康老龄化的新策略。
- 研究局限性
- 样本与验证
受限于样本量，未对组学鉴定的候选分子（如特定miRNA或蛋白质）进行qPCR或Western blot等靶向验证。
- 分离技术
超速离心法提取LFEs并非绝对纯净，可能存在共沉淀的细菌膜囊泡、细胞碎片、非囊泡颗粒等，其潜在影响需注意。该方法也较难应用于大规模人类样本。
- 机制深度
研究主要做了全面的描述和多组学关联，但尚未充分解析导致肠道屏障损伤和代谢紊乱的具体效应通路和关键分子。未来的研究需要聚焦于敲除或抑制候选分子，进行更深入的机制验证。
结果译文：
为评估肠道腔外泌体对年轻（3月龄）和老年（24月龄）雄性和雌性小鼠的影响，我们设计了一个实验框架以评估年龄和性别依赖的效应对宿主多组学谱的影响（图1A）。该实验设计概述了按年龄和性别对小鼠进行分组，以及随后整合下游多组学分析以表征LFE相关的分子变化。
通过电子显微镜评估了LFEs的大小形态，并进行定量和蛋白质标志物（包括tetraspanin蛋白）检测（图1B-1D）。通过EM负染确认了LFEs的形状和外泌体标志物的表达（图1B），并通过NTA评估了正确的尺寸范围（30-150 nm）（图1C）。YM中LFEs的平均大小为（2.01×10¹⁰），OM为（2.06×10¹⁰），YF为（1.81×10¹⁰），OF为（1.95×10¹⁰），（p值-所有比较均不显著）如图1C所示。我们进一步确认了CD63作为一种典型的tetraspanin外泌体标志物的存在（图1D）。
接下来，我们用PKH26染料标记LFEs，并通过共聚焦显微镜可视化了它们被小肠细胞摄取的情况。老年雄性LFE条件作为代表性示例展示；在其他组中也观察到了类似的摄取（图S1A）。
老年小鼠的收缩压和舒张压均显著高于年轻组（图S1A）。OM小鼠具有最高的收缩压（112.38 ± 9.66 mmHg），其次是OF（104.25 ± 6.42 mmHg），YM（95.51 ± 3.57 mmHg）和YF（92.88 ± 5.84 mmHg）表现出较低的血压水平（p < 0.05, n = 8-10/组）。舒张压出现了类似的结果：OM：77.25 ± 2.88 mmHg；OF：67.32 ± 3.26 mmHg；YM：63.16 ± 5.78 mmHg；YF：65 ± 5.21 mmHg（p < 0.05, n = 8-10/组）（图S2A,B）。这些发现表明，年龄是血压升高的主要驱动因素，而性别调节了这种效应的大小，特别是在老年动物中。此模式与年龄相关的血管变化一致，并提示老年雄性小鼠可能更容易出现高血压表型。
肠道屏障是宿主与外部环境之间通讯的一个重要系统。因此，我们检测了来自年轻和老年小鼠的LFEs对肠道屏障完整性的影响（图2）。各组的标准化基线肠道屏障电阻（Ohms）如下：YM（0.94 ± 0.03）、OM（0.84 ± 0.11）、YF（0.96 ± 0.02）和OF（0.88 ± 0.06）（图2A）。与YM相比，来自YF的LFEs引起的电阻下降较小，OF与OM LFEs的比较也有类似发现（图2B）。来自每组小鼠的LFEs引起的实际下降为：YM（-7.01 ± -0.74）、OM（-20.88 ± -2.24）、YF（-4.65 ± 0.54）和OF（-15.91 ± -1.52）。我们发现以下组间存在显著差异：YM vs. OM（p = 0.005）以及OM vs. YF vs. OF（p = 0.03），而OM与OF之间无显著差异（p = 0.47）。这些结果提示，年龄和性别均影响标准幼稚肠道单层屏障的应答，其中老年雄性的破坏性最强，表现为肠道细胞屏障电阻的显著下降。
为评估肠道通透性，使用微流控系统将来自年轻和老年雄性和雌性小鼠的LFEs施加于小肠细胞。将FITC-葡聚糖添加到腔内侧，并使用荧光显微镜检测肠道通透性。如图2C所示，与YM和YF组相比，OM和OF组的肠道细胞层FITC荧光显著增加，表明来自老年小鼠的LFEs增加了肠道细胞通透性（图2C,D）。
来自老年小鼠的LFEs比来自年轻小鼠的LFEs更严重地损害了肠道屏障完整性并增加了肠道通透性。此效应在老年雄性中最强。总体而言，年龄和性别均影响粪便来源因子破坏肠道屏障的方式，其中衰老为主导因素。
采用口服FITC-葡聚糖荧光作为肠道屏障完整性的指标，在体内评估了肠道通透性。如图2E所示，观察到肠道通透性存在显著的年龄和性别依赖性差异。年轻雄性（YM）小鼠展现出相对较低的血浆FITC-葡聚糖水平（970.11 ± 170.78），表明肠道屏障功能得以保存。相反，与YM小鼠（970.11 ± 170.78）相比，老年雄性（OM）小鼠的循环FITC-葡聚糖显著增加（3615.33 ± 396.27）（p < 0.0001），反映了肠道通透性的显著增加。这一发现表明雄性肠道屏障完整性存在显著的年龄相关损伤。在雌性中，年轻雌性（YF）小鼠展现的血浆FITC-葡聚糖水平与YM小鼠相当，两个年轻组之间无显著差异（ns）。然而，与YF小鼠（1012.15 ± 183.76）相比，老年雌性（OF）小鼠展示出显著升高的FITC-葡聚糖水平（1781.34 ± 500.85）（p < 0.01），表明雌性同样存在年龄相关的肠道通透性增加。
基于性别的差异也很明显。OM小鼠展示出比OF小鼠（1781.34 ± 500.85）显著更高的血浆FITC-葡聚糖水平（3615.33 ± 396.27）（p < 0.01），提示与衰老雌性相比，衰老雄性的肠道屏障功能障碍程度更严重。YM和YF组之间未观察到显著的性别差异。综合这些数据证明，无论雌雄，肠道通透性均随年龄增加而增加，其中在老年雄性中观察到的破坏更为显著。这些体内发现为肠道屏障完整性的年龄和性别依赖性改变提供了强有力的支持，并与体外观察到的功能变化一致。我们的数据提示，衰老改变了肠道来源外泌体携带的“信息”，而这些信息可使肠道屏障更易渗漏，可能促进与年龄相关的炎症或疾病。
为评估LFEs对小鼠胰岛素敏感性的影响，我们在年轻幼稚受体小鼠中灌胃来自年轻和老年小鼠的LFEs后，进行了葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。与接受来自YM和YF小鼠LFEs的小鼠相比，接受来自OM和OF小鼠LFEs的小鼠的血糖水平显著更高（图3A）。曲线下面积分析揭示，与年轻小鼠LFEs处理的小鼠（3640.51 ± 320.19 mg/dL）相比，老年小鼠LFEs处理的小鼠（5322.33 ± 349.59 mg/dL，p < 0.0001；图3B）存在糖耐量受损。这些数据得出结论，LFEs携带年龄依赖性因子，对代谢调节产生负面影响。来自老年小鼠的LFEs足以在原本健康的年轻小鼠中诱导葡萄糖耐量异常，提示衰老以促进胰岛素抵抗的方式改变了循环细胞外组分。ITT实验中胰岛素注射在15和30分钟时间点导致血糖水平在统计学上显著降低（图3C）。
然而，与来自年轻小鼠的LFEs相比，用来自老年小鼠的LFEs灌胃显著降低了胰岛素敏感性（图3C）。OM处理的小鼠AUC（2767.67 ± 128.97）显著高于年轻雄性（YM）LFEs处理的小鼠（1597.17 ± 168.69，p = 0.0001）。类似地，与年轻雌性（YF）LFEs处理的小鼠（1755.33 ± 146.72，p = 0.0001）相比，老年雌性（OF）LFEs处理的小鼠展现出更高的AUC值（2472.11 ± 146.54）（图3D）。综合来看，来自老年小鼠的LFEs在年轻受体小鼠中诱导胰岛素抵抗。尽管胰岛素仍可降低血糖，但其效力减弱，表明与衰老相关的LFEs干扰了胰岛素信号传导或下游葡萄糖摄取。我们的数据提示，衰老改变了粪便外泌体的生物学货物，这些改变的LFEs可促进葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗，从而可能促进与年龄相关的代谢疾病。
6.来自年轻和老年小鼠的LFEs的16S rRNA测序
接下来，我们对用于提取老年小鼠（供体）LFEs的粪便样本以及接受来自年轻和老年小鼠LFEs的受体小鼠（即4个实验组：有LFEs的年轻[YW]、无LFEs的年轻[YN]、无LFEs的老年[ON]和有LFEs的老年[OW]）的粪便样本进行了16S rRNA测序。这些比较揭示了不同分类群在微生物丰度和多样性方面的显著差异（表S1）。观察到了细菌群落结构的转变，具有不同的log₂倍性变化和统计学显著性（表S1）。
在YN与YW的比较中，YN具有更高水平的Lachnospiraceae（log₂FC = 3.29）、Peptococcaceae、Erysipelatoclostridiaceae和Clostridia_UCG-014。YW展示出更高的Bifidobacteriaceae和Candidatus_Saccharimonas。在ON与YN的比较中，ON增加了Defluviitaleaceae、Erysipelatoclostridiaceae和Lachnospiraceae，而Muribaculaceae和Clostridia_vadinBB60在YN中更丰富。OW与ON的比较显示了OW中Dubosielia、Muribaculaceae、Bifidobacterium和Faecalibaculum的富集。在OW与YW的比较中，OW具有更高的Dubosielia、Bifidobacterium和Peptococcaceae，而Oscillibacter更低。
每组的扩增子序列变体检测数分别为：YN（83.17 ± 3.02）、YW（91.01 ± 3.83）、ON（74.40 ± 3.99）和OW（65.5 ± 5.19）。在YN vs. YW（p = 0.03）、YN vs. ON（p = 0.02）、YN vs. OW（p = 0.0001）、YW vs. OW（p = 0.0001）和ON vs. OW（p = 0.01）之间观察到显著差异。这些数据表明，LFEs以显著的年龄依赖性方式重塑肠道微生物群，影响群落组成和多样性，且在年轻与老年受体中产生不同的结果。年龄单独即可改变微生物组，但LFEs以在不同年龄组间不均匀的方式进一步改变了这一基线。
为了定义肠道腔外泌体货物中年龄和性别依赖的分子变化，我们对宿主和微生物来源的蛋白质进行了LC-MS/MS蛋白质组学分析。差异表达蛋白的热图分析揭示了清晰的年龄和性别特异性模式。在各样本中，检测到约500-750个蛋白质，其中122个在各组间共享。在使用小鼠基因组进行的OM与OF比较中，Annexin A2和Annexin A4在OM中显著上调，而参与消化、代谢和免疫的蛋白质（包括Reg3g、白蛋白、转酮醇酶、α-淀粉酶和Klk1）则下调（表S2）。其他比较分别识别出OM vs. YM中95个DEPs、OF vs. YF中89个、OM vs. OF中64个，以及YM vs. YF中45个（表S3-S5）。聚类分析进一步展示了跨年龄和性别组的独特蛋白质组轨迹（图S4和图4）。肠道腔外泌体的蛋白质组学分析比较了老年雄性和老年雌性小鼠，并以热图形式呈现。宿主来源的小鼠蛋白质谱见图4A，细菌蛋白质谱见图4B。使用小鼠和细菌蛋白质组学数据集进行了GO和KEGG通路的功能富集分析。在OM vs. OF中，胰腺分泌、肾素-血管紧张素系统和碳代谢等通路突显了营养处理和心血管代谢功能的差异。在OM vs. YM中，比较揭示了蛋白酶体、胰腺分泌以及与神经退行性病变相关的通路（帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症）的富集，同时伴有消化和吸收方面的转变。在OF vs. YF中，蛋白酶体、胰腺分泌和神经退行性通路（阿尔茨海默病、朊病毒病）被富集，反映了与衰老相关的脆弱性。YM vs. YF比较显示了胰腺分泌、蛋白质和脂肪消化以及甘油酯代谢中的性别特异性差异，表明年轻小鼠具有独特的代谢特征（表S7-S9）。细菌胞外囊泡蛋白质组学揭示了显著的年龄和性别依赖性差异。在OM vs. OF中，来自拟杆菌及相关类群的几种核糖体蛋白（包括30S S5和50S L7/L12）在OM中减少，提示翻译活性降低。延伸因子、代谢酶和能量转移蛋白（例如，磷酸丙酮酸水合酶、NADP特异性谷氨酸脱氢酶、电子转移黄素蛋白、UgpC）的变化指示微生物代谢和能量利用的改变。鞭毛蛋白减少提示运动性降低，而参与氨基酸和碳水化合物代谢的酶的变化反映了功能性重塑。OM vs. YM分析显示，OM中与翻译、代谢和结构功能相关的微生物蛋白丰度增加。在OF vs. YF中，衰老与蛋白质合成和多种代谢通路相关蛋白的富集有关，包括延伸因子Tu、苹果酸脱氢酶、甲酸-四氢叶酸连接酶、乙酰辅酶A羧化酶和电子转移黄素蛋白。在YM vs. YF中，仅观察到轻微差异，包括酮醇酸还原异构酶的轻度上调，提示存在微妙的性别相关代谢变异（表S10-S14）。总之，整合的宿主-微生物LFE蛋白质组学揭示了显著的年龄和性别特异性功能重塑，为超越分类学分析的肠道来源分子变化提供了机制性见解。
miRNAs是肠道腔外泌体货物的关键功能组分，在细胞间通讯和下游生物学调控效应中发挥重要作用。为识别年龄和性别相关的miRNA表达差异，我们对从年轻和老年雄性和雌性小鼠分离的LFEs进行了小RNA测序。在老年雄性vs.老年雌性（OM vs. OF）中，我们识别出11个差异表达的miRNAs（DEMs）（表S14）。我们还在OM vs.年轻雄性（YM）中识别出5个DEMs，OF vs.年轻雌性（YF）中5个，以及YM vs. YF中2个（表S14）。差异表达的miRNAs（DEMs）采用热图可视化。OM vs. OF比较见图5A，而OM vs. YM、OF vs. YF和YM vs. YF分别见图S5A-C。组间识别出的显著miRNAs进一步用于构建miRNA-基因相互作用网络。OM vs. OF比较中11个显著miRNAs的网络见图5B，而OM vs. YM、OF vs. YF和YM vs. YF的网络分别见图S6A-C。总体而言，LFE miRNA分析揭示了独特的年龄和性别依赖性表达模式。值得注意的是，这些差异即使在年轻小鼠中也很明显，提示在生命早期即已建立性别特异性的miRNA调控，可能促成不同的生理功能和衰老轨迹。
对推定的miRNA靶基因进行了KEGG通路富集分析，以探究与年龄和性别依赖性miRNA表达变化相关的分子过程（表S15）。在OM vs. OF中，富集通路包括轴突导向、MAPK和PI3K-Akt信号传导，反映了神经和细胞内信号传导的性别特异性差异。癌症相关通路、mTOR和ErbB信号传导以及自噬/线粒体自噬通路也很突出。Rap1、Ras和TGF-β信号的额外富集提示细胞通讯和免疫相关机制发生了改变。在OM vs. YM中，富集通路包括Polycomb抑制复合体和轴突导向，表明衰老过程中基因调控和神经过程发生了改变。关键信号通路如MAPK和mTOR显著富集，同时伴有自噬相关通路（自噬和线粒体自噬），突显了细胞生长、应激反应和质量控制方面的变化。癌症相关通路、长寿调控通路和细胞粘附通路（粘附连接和Rap1信号）也被富集，提示对衰老相关疾病和细胞通讯的更广泛影响。在OF vs. YF中，靶基因强烈富集了PI3K-Akt信号和粘着斑，这些对细胞存活和增殖至关重要。多条癌症相关通路显著，以及长寿调控和代谢通路，包括胰岛素抵抗和胆碱代谢。凋亡、自噬和MAPK/mTOR信号的富集进一步支持这些miRNAs在衰老过程中调控细胞死亡、代谢和生长的作用。YM vs. YF中未识别出显著通路。
富集的通路指向上皮细胞调控、结构和应激反应的广泛变化。关键的生长和存活通路（MAPK、PI3K-Akt、mTOR、Ras、p53、FoxO）提示细胞更新、代谢和损伤应答的控制发生改变，与衰老相关的转变和修复受损相一致。涉及细胞骨架调控、粘着斑和细胞间连接的通路表明上皮结构减弱，支持肠道屏障完整性降低和通透性增加的证据。自噬和线粒体自噬的变化突显了细胞维护和线粒体质量控制的中断，这些过程通常受衰老和炎症影响。Polycomb相关通路的富集提示基因调控中存在更稳定、长期的变化，而不仅仅是短暂的信号效应。与神经相关的通路如轴突导向和神经营养因子信号，可能反映其在细胞迁移、极性和组织组织化中的作用，而非神经元活动。癌症相关通路的出现是因为它们共享了参与生长、存活、粘附和炎症的核心信号网络，而非因为癌症本身。总体而言，这些发现表明所研究的条件影响了上皮稳定性、细胞内信号传导、应激处理和长期调控程序，这些与观察到的肠道屏障功能障碍一致。
为进一步明确miRNA-基因调控关系，使用miRNet构建了miRNA-靶标相互作用网络（图5B）。在OM vs. OF中，11个miRNAs与预测的基因靶标关联，形成了一个相互作用网络（图6B）。OM vs. YM比较识别出5个miRNAs，通过共享的基因网络连接（图S6A）。在OF vs. YF中，检测到5个miRNAs，其中只有两个（miR-192-5p和miR-429-3p）共享一个共同靶基因Hist1h1d（图S6B）。在YM vs. YF比较中，识别出两个miRNAs；然而，未观察到共享的基因相互作用，因为每个miRNA靶向不同的基因（图S6C）。miRNA-151-5p和miRNA-191-5p的靶标网络分别见图S6C1和C2。
使用多块分析，生成了环状图以整合来自miRNAs、宿主来源蛋白质组学和细菌来源蛋白质组学的数据。每个图的外环分为三个部分：miRNAs、小鼠蛋白质和细菌蛋白质。圆内的线指示相关性（r ≥ 0.8作为阈值），红线代表正相关，蓝线代表负相关，直观展示了这些生物分子之间的相互作用。内部线条反映相关类型，而外部线条指示两组间的表达水平。这些图突显了老年小鼠（OM vs. OF）之间与年龄相关的表达差异，分别用蓝色和橙色线表示（图S6）。特定的环状图比较了OM vs. YM（图S7A）、OF vs. YF（图S8）和YM vs. YF（图S9）。总的来说，这些整合分析表明，LFEs携带了以年龄和性别依赖性方式连接细菌蛋白、宿主蛋白和miRNAs的协调分子特征。在这些生物分子之间观察到的强相关模式提示，LFEs作为微生物组-宿主通讯的平台，随衰老而发生变化。年轻与老年小鼠之间的比较揭示了这些相互作用网络中与年龄相关的重塑，而雌雄之间的差异突显了尤其在年轻动物中明显的性别特异性调控通路。综合这些数据支持了衰老和性别塑造了不同的LFE介导的分子网络的结论，微生物组可能通过这些网络影响宿主生理。
更多结果和补充图表：doi： 10.1111/acel.70455
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