本研究整合多区域采样RNA-seq、单细胞转录组及拷贝数变异等多组学数据，系统揭示肝内胆管癌（iCCA）基因表达异质性的主要驱动因素——肿瘤微环境变异，导致现有分子分型中位27.8%的误分类。通过筛选低瘤内异质性/高瘤间变异性基因集，建立抗采样偏倚的五亚型分类系统：炎性、代谢、非典型、免疫沉默及神经退行性亚型。各亚型呈现独特的临床结局、驱动突变、免疫景观及治疗脆弱性。其中炎性iCCA对HSP90抑制剂联合抗PD1敏感，神经退行亚型响应抗PD1/抗TIM3组合。研究进一步鉴定出GPRC5A和VTCN1作为炎性及SIII亚型特异性免疫组化标志物，血清CEA和CA19-9可无创识别炎性iCCA。该框架为iCCA精准分层与靶向治疗提供了稳健的分子基础。
今天给大家解读一篇3月发表在《Cell Reports Medicine》上的题目为“Robust transcriptomic hallmarks targeting intratumor heterogeneity in intrahepatic cholangiocarcinoma.”的文章。文章旨在解决肿瘤内异质性削弱基于转录组的肝内胆管癌分型这一问题。通过整合多组学数据，研究系统刻画了基因表达的ITH，发现现有分型系统因此对中位27.8%的肿瘤产生误分类。研究进而鉴定出LIHV基因集，并开发了新的ITH不敏感分类系统，定义了五个亚型（SI-SIII-3）。这些亚型具有不同的临床结局、分子特征、免疫微环境和治疗敏感性，并提供了配套的生物标志物及联合治疗策略。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《针对肝内胆管癌肿瘤内异质性的稳健转录组特征》Robust transcriptomic hallmarks targeting intratumor heterogeneity in intrahepatic cholangiocarcinoma
发表期刊：Cell Reports Medicine
影响因子：10.6
研究背景：
肿瘤内异质性（ITH）削弱了基于转录组的肝内胆管癌（iCCA）分层。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
整合来自多区域、单区域和单细胞RNA测序队列的多组学数据，以系统地表征基因表达的肿瘤内异质性（ITH）。在此基础上，识别受ITH影响小的基因特征，并开发新的分类系统。
研究亮点：
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揭示了免疫和基质异质性是iCCA肿瘤内异质性的主要驱动因素。
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开发了一个基于LIHV基因集的、对ITH不敏感的新型分子分型系统，将iCCA分为五个亚型。
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鉴定了可用于区分亚型的组织学（GPRC5A， VTCN1）和血清（CEA， CA19-9）生物标志物。
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明确了不同亚型特异性的治疗脆弱性，如炎症型iCCA对HSP90抑制剂联合抗PD1疗法敏感，神经退行型iCCA可被抗PD1联合抗TIM3疗法抑制。
研究结果：
- ITH的驱动因素与影响
免疫和基质异质性是ITH的主要驱动因素，这导致现有分型系统对中位27.8%的肿瘤产生误分类。
- 新分类系统的建立
鉴定出一个低肿瘤内异质性/高肿瘤间变异性（LIHV）的基因集，并据此建立了一个对ITH不敏感的分类系统，将iCCA分为五个亚型：炎症型（SI）、代谢型（SII）、非典型型（SIII-1）、免疫静默型（SIII-2）和神经退行型（SIII-3）。
- 亚型特征
这些亚型表现出不同的临床结局、分子特征、免疫景观和治疗脆弱性。
- 生物标志物
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GPRC5A和VTCN1可作为SI和SIII肿瘤的稳健免疫组织化学生物标志物。
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血清CEA和CA19-9可用于识别炎症型iCCA。
- 治疗策略
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HSP90抑制剂与抗PD1联用对炎症型iCCA具有协同作用。
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抗PD1与抗TIM3联合可抑制神经退行型iCCA。
研究总结：
本研究为肝内胆管癌（iCCA）提供了一个克服肿瘤内异质性干扰的稳健分子分型框架。该框架不仅明确了五个具有显著差异的分子亚型及其对应的生物标志物，还指出了亚型特异性的联合治疗策略（如针对炎症型的HSP90抑制剂联合抗PD1，以及针对神经退行型的抗PD1联合抗TIM3），从而提供了可操作的精准治疗路径。
结果译文：
为刻画iCCA中基因表达ITH的特征，我们分析了来自既往研究的多区域采样iCCA队列（45例患者，205个肿瘤亚区，每例患者3-6个亚区）的RNA-seq谱，并进行无监督层次聚类。与其他癌症中的发现一致，大多数瘤内亚区按患者聚类（45例中37例），而8例患者呈现分离的亚区（图1A）。基于MSigDB标志物评分的聚类同样揭示了40例患者（88.9%）肿瘤内亚区的分离，确认iCCA中基因表达ITH普遍存在（图S1A）。
我们通过计算每个基因跨亚区的标准差来量化基因表达ITH，并在基因和患者水平汇总评分（表S1）。在患者水平，8例具有分离肿瘤亚区的患者表现出显著更高的ITH（p < 0.001；图S1B）。为探究基因表达ITH的潜在原因和影响，我们检查了其与临床病理特征、复发基因变异及患者预后的可能关联，但未发现显著相关性（图S1C和S1D）。有趣的是，我们观察到患者水平基因表达ITH与肿瘤纯度（Rho = 0.381，p = 0.010）、免疫评分（Rho = 0.360，p = 0.015）及基质评分（Rho = 0.539，p < 0.001）呈正相关（图1B）。相反，与单核苷酸变异（Rho = 0.303，p = 0.043）或拷贝数变异（Rho = 0.215，p = 0.156）的相关性较弱（图S1E），提示肿瘤微环境是基因表达ITH的主要贡献者。此外，我们通过使用每个肿瘤不同数量的亚区模拟患者水平基因表达ITH以评估采样数量对基因表达ITH的影响。结果显示大多数肿瘤中ITH评分在约四个样本后趋于平台（图1C），表明约四个亚区的采样通常足以捕获iCCA内基因表达的多样性。
在基因水平，基质和免疫细胞标志物相比其他基因表现出更高的基因表达ITH评分（图1D和S1F），通过九种免疫估算方法评估。这一发现进一步得到了与基质和免疫细胞相关的标志物（如血管生成、同种异体移植排斥和炎症反应）ITH评分升高的支持（图1E）。相反，增殖相关标志基因表达ITH水平较低，包括MYC靶标、有丝分裂纺锤体、E2F靶标和G2M检查点。涉及蛋白质分泌和DNA修复的基因ITH评分最低（图1E）。综合而言，这些结果表明肿瘤微环境是基因表达ITH的关键驱动因素，并突显了利用单区域采样转录组数据的挑战。
为评估基因表达ITH如何影响分子分型，我们将八种已发表的iCCA转录组分型方法应用于我们的多区域采样队列（表S2）。每个肿瘤亚区被分配一个分子亚型，同一肿瘤内的不同亚区可显示不一致的亚型（图2A）。使用这些分子分型方法，我们发现中位27.8%（范围0%-71.1%）的肿瘤受到采样偏倚影响，即根据采样的亚区不同，肿瘤可被分类为不一致的亚组（图2B）。值得注意的是，免疫分型（中位：66.7%，范围：22.3%-71.1%）相比非免疫分型（中位：4.4%，范围：0%-35.6%）更易受到基因表达ITH诱导的采样偏倚影响。这些发现突显了在存在基因表达ITH的情况下实现稳健分型的挑战。
为定量评估使用这些转录组分型方法中基因集的亚组分型能力和个体患者聚类的稳健性，我们使用这些基因集进行层次聚类，并将肿瘤亚区逐步分为2-45个簇。随后计算一致性患者的比例，并绘制聚类一致性曲线。聚类一致性曲线清晰显示不同基因集受ITH影响程度各异，其中Andersen的基因集受影响较小，而Job的基因集则显示更大的敏感性（图2C）。我们还基于每个单基因绘制聚类一致性曲线，并将半数患者聚于相同簇时的簇数定义为聚类一致性评分。因此，每个基因被赋予一个聚类一致性评分（图S2A；表S2），且八个基因集的聚类一致性评分与聚类一致性曲线趋势相似（图S2B）。
为探究潜在机制，我们分析了三个最近发表的iCCA单细胞RNA-seq队列的转录组数据，并量化了八个基因集在不同细胞类型中的表达。值得注意的是，八个基因集显示不同的表达分布（图2D和S2C）。基因随后基于在三个scRNA-seq iCCA队列中肿瘤细胞与其他细胞类型之间的显著差异表达分为三组：肿瘤细胞高表达、肿瘤细胞低表达及其他。在八个基因集中，Andersen的基因集包含最高比例的肿瘤细胞高表达基因，而Job的基因集则具有最高比例的肿瘤细胞低表达基因（图2E）。这些发现提示肿瘤细胞特异性基因可能受基因表达ITH影响较小。
除分子分型外，基因表达ITH也使预后模型复杂化。我们收集了七种已发表的iCCA预后表达特征，并计算每个肿瘤亚区的风险评分（表S2）。肿瘤亚区根据风险评分中位截断值分为高风险或低风险，患者被归为一致高风险、一致低风险或不一致亚组。我们发现中位46.7%（范围33.3%-57.8%）的患者同时具有高风险和低风险肿瘤亚区，表明这些预后表达特征的效能可能受到ITH的显著影响（图2F）。例如，使用Wada的预后模型，分别有20.0%、22.2%和57.8%的患者被分类为一致低风险、一致高风险和不一致（图S2D）。因此，超过半数的患者面临误分类风险并可能接受不适当的治疗。综上，这些发现强调基因表达ITH影响大多数现有分子分型和预后表达特征，增加iCCA误分类风险。
理想的分子分型基因集应同时具有有限的ITH以减少采样偏倚影响，以及足够的瘤间异质性以有效区分不同肿瘤。我们初步采用三个scRNA-seq队列定义的肿瘤细胞高表达基因，并绘制相应的聚类一致性曲线（图S3A）。尽管这些肿瘤细胞特异性基因表现显著，但未达到最佳分类稳健性（图S3B）。这可能归因于肿瘤微环境也包含对准确肿瘤识别至关重要的信息。
因此，我们优化筛选策略，在表达水平绘制每个基因的ITH和瘤间异质性评分。进行分位数回归以评估ITH与瘤间异质性之间的关系。建立两个标准选择目标基因：（1）瘤间异质性评分高于均值，及（2）位于回归线下方且超出95%置信区间的基因。该方法鉴定出1,341个表现出相对较高瘤间异质性而非ITH的基因（图3A；表S3）。所得基因集，称为低瘤内异质性/高瘤间变异性基因集，在聚类一致性曲线中展示最佳分类稳健性（图3B），且相比其他基因集具有最高的聚类一致性评分（图S3C）。
我们将八个已发表转录组分型方法的基因集标注于散点图，观察到不同的分布模式（图3C）。具体而言，Andersen、Job和Sia的基因集分别主要聚集于右下、右上和左侧区域（图3C）。该分布表明Andersen的基因集受ITH影响较小，而Job的则更易受影响。与此一致，Andersen的基因集具有最高比例的LIHV基因（47.2%，p < 0.001），而Job的基因集（3.8%，p = 0.003）和Sia的基因集（3.3%，p < 0.001）包含显著较低的比例，与其各自的分类稳健性相关（图3B和3D）。这些结果表明LIHV基因集在肿瘤内不同亚区间表现均质表达，且在不同iCCA间具有强区分能力。
由于LIHV基因集捕获了肿瘤识别的关键特征，我们进一步探究了其分类性能背后的生物学机制。来自三个scRNA-seq队列的表达谱揭示LIHV基因集包含在多种细胞类型中高表达的基因，其中肿瘤细胞占比最大（图3E和S3D）。KEGG通路分析表明富集于药物代谢、O-聚糖生物合成和MAPK信号通路（图3F），与MAPK信号和聚糖生物合成在早期iCCA肿瘤发生中的关键作用一致。为探索这些观察的遗传基础，我们比较了LIHV基因集与其他基因的拷贝数改变模式。该分析揭示LIHV基因集中克隆性拷贝数增加显著富集，而克隆性和亚克隆性丢失均减少（图3G），提示早期拷贝数增加可能促进跨肿瘤亚区的稳健表达。此外，LIHV基因集在mRNA表达与蛋白质丰度之间显示强正相关（中位：0.76；范围：-0.09至0.92），支持其在蛋白质组学中的应用潜力（图S3E）。最后，我们评估了每个基因表达与肿瘤纯度的相关性，发现LIHV基因集的分布与其他基因相似（图S3F），表明其鉴定未受肿瘤纯度偏倚。综上，我们鉴定了一个在表达水平具有LIHV特征的核心基因集，为其与iCCA肿瘤发生的潜在关联提供了见解。
为建立最大化瘤间差异同时最小化瘤内采样偏倚的稳健分子分型，我们使用LIHV基因集对四个iCCA队列（Fu-iCCA、HRA004766、OEP002768和GSE89749；表S4）进行共识聚类，并定义五个转录组亚组：炎性、代谢、非典型、免疫沉默和神经退行性（图4A和S4A-S4D）。预后分析揭示这些亚组之间显著生存差异，其中神经退行性iCCA预后最佳，而炎性iCCA预后最差（图4B和S4E）。这五个亚组与临床病理特征（包括肝炎病史和肿瘤分期）以及组织学亚型相关（图4A和S4F）。炎性iCCA富集大导管型，而小导管型主要在代谢和免疫沉默亚组中（图S4E）。不同亚组也显示不同的驱动突变谱，其中炎性iCCA以KRAS突变和染色体1q和8q扩增为特征；代谢亚组富集IDH1/2突变和FGFR2融合；神经退行性亚组富集BAP1突变；免疫沉默亚组富集TP53突变和染色体9p21.3缺失（图4C和S4G-S4I）。通路富集分析揭示亚组特异性生物学特征：炎性iCCA显示炎症反应、IL6-JAK-STAT3和KRAS信号上调；代谢iCCA富集胆汁酸和脂肪酸代谢；神经退行性亚组与神经活性配体-受体相互作用和钙信号相关（图4D和S5A-S5E）。综上，LIHV定义的分类系统捕捉了iCCA中生物学和临床上不同的亚型。
为描绘各亚组的免疫景观，我们使用多种免疫分析工具评估免疫细胞丰度。炎性iCCA以高中性粒细胞浸润和免疫抑制分子（PD-L1、TIM-3、IDO1）表达为特征；代谢亚组显示相对较高的抗肿瘤免疫细胞（CD8+ T细胞、活化NK细胞）和免疫检查点表达；神经退行性亚组表现为免疫抑制性TIM-3上调，而免疫沉默亚组整体免疫浸润较低（图5A-5C和S6A-S6D）。免疫组化验证证实炎性iCCA中CD66b+中性粒细胞升高，而代谢亚组中CD3+ T细胞和CD20+ B细胞更丰富（图5B）。趋化因子分析显示炎性iCCA中CXCL5表达升高且与中性粒细胞浸润相关（图5D），功能实验证实CXCL5促进中性粒细胞迁移（图S6E-S6H）。综合而言，LIHV亚组展示不同的免疫微环境特征，为亚型特异性免疫治疗策略提供依据。
为评估亚组间的药物敏感性差异，我们分析了iCCA类器官药物筛选数据。炎性iCCA类器官对HSP90抑制剂（ganetespib）、RTK抑制剂（TAE684）和促凋亡药物（ABT-263、YM155）更敏感，符合其增强的凋亡信号和药物代谢基因低表达（图6A和S8A）。使用九种计算工具预测免疫治疗敏感性显示代谢亚组最敏感，而炎性亚组最耐药（图6B），与其免疫检查点上调一致（图5C）。
为模拟体内条件，我们对KTP细胞来源的肿瘤组织进行RNA-seq，并与常用iCCA鼠HTVI模型整合。NTP预测将KRAS/p19和KRAS/Trp53模型归为炎性亚组，而NICD/AKT和YAP/AKT模型分别再现免疫沉默和神经退行性亚组（图6C）。在KTP细胞中，HSP90抑制剂（ganetespib）显示最强抗肿瘤反应（IC50 = 3.9 nM），并被选用于炎性iCCA的联合治疗（图6D）。在KRAS/p19和KRAS/Trp53 HTVI模型中，抗PD1单药疗效有限，而alvespimycin（HSP90抑制剂）及其与抗PD1联合显著降低CK19+肿瘤区域比例，其中联合治疗效果最佳（图6F、6G和S8B、S8C）。在KTP皮下移植瘤模型中，ganetespib和联合治疗显著抑制肿瘤生长，而抗PD1单药无效（图6H和S8E）。这些发现表明HSP90抑制可有效抑制炎性iCCA肿瘤进展，并可能增强抗PD1疗效。
对于特异性上调TIM-3表达的神经退行性iCCA（图5C），我们在YAP/AKT HTVI模型中测试了抗PD1和抗TIM3联合策略。联合治疗相比对照和抗PD1单药显著减少CK19+肿瘤区域比例（图6I和S8F），表明该组合可能是神经退行性iCCA的有前景治疗策略。所有治疗耐受性良好，研究结束时各组体重无显著差异（图S8G）。
为促进分型的临床转化，我们进行了监督分析以鉴定能够区分不同iCCA亚组的免疫组化生物标志物。在LIHV基因集中，我们鉴定出在至少三个队列中于炎性亚组显著上调的176个基因，以及于SIII亚组上调的71个基因（图S9A）。经过严格筛选，六种炎性特异性和六种SIII特异性基因被选出，各基因在亚组间显示独特表达模式（图S9C）。我们在Fu-iCCA队列配对组织芯片上进行免疫组化并量化H-score。这些基因主要在肿瘤细胞中表达（图7A、S9D和S9E）。炎性iCCA显示GPRC5A、S100P和CEACAM5的H-score显著升高，而SIII iCCA显示VTCN1、FXYD2、CHST9、ANXA9、DCDC2和ZBTB20的H-score升高（图7B和S10A）。ROC曲线显示GPRC5A、S100P、CEACAM5、VTCN1、FXYD2和CHST9的AUC分别为0.853、0.818、0.805、0.814、0.790和0.750（图7C）。GPRC5A在区分炎性iCCA时诊断效能最佳（敏感性72.3%，特异性90.6%），而VTCN1在SIII iCCA中表现最优（敏感性68.7%，特异性80.6%）（表S7）。
我们根据GPRC5A和VTCN1的最优H-score截断值将iCCA样本分为四个象限，准确率达65.9%（112/170；图7D）。在独立验证队列中，GPRC5A和VTCN1免疫组化将肿瘤分类为SI、SII、SIII或未分类iCCA（图7D）。值得注意的是，SI、SII和SIII iCCA患者显示显著生存差异（p < 0.001），SIII预后最佳而SI最差（图7E）。
此外，我们评估了两种常见血清生物标志物CA19-9和CEA在iCCA中的分型价值。两种生物标志物在炎性iCCA病例中均显著升高（图7F和S10C）。血清CEA和CA19-9的AUC在Fu-iCCA队列中分别为0.773和0.797，在HRA004766队列中分别为0.836和0.700（图7G）。这些发现强调了血清CEA和CA19-9在炎性iCCA无创诊断中的潜力（表S7）。综上，这些发现揭示了一组具有显著潜力改善临床iCCA分层的亚型特异性免疫组化和血清标志物。
更多结果和补充图表：doi：10.1016/j.xcrm.2026.102708
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