2区4.9分！【纯生信】单细胞转录组学+虚拟敲除算法公共数据库挖掘与生信分析，揭示PDK4通过脂肪酸代谢驱动非创伤性股骨头坏死中血管生成

非创伤性股骨头坏死（NONFH）常因激素和酒精滥用导致股骨头血供中断、骨修复受限，最终引发股骨头塌陷。但其微环境中血管内皮细胞（EC）的异质性及修复机制尚不清楚。本研究通过挖掘公共单细胞RNA测序数据库，运用CytoTRACE伪时序分析、CellChat细胞通讯网络及ScTenifoldKnk虚拟敲除算法等生信分析，首次系统鉴定出股骨头内Type H、Type R、Type L和动脉EC四种特殊亚群。研究发现，Type H和Type R型EC作为促血管生成和骨修复的关键亚群，其丰度在疾病中期（ARCO 3a期）代偿性增加，而在晚期（ARCO 4期）出现功能衰竭。进一步筛选发现，PDK4是协同调控这两群EC动态变化的核心基因。PDK4通过驱动脂肪酸氧化代谢重编程，替代糖酵解为ECs提供能量，并赋予细胞抵抗铁死亡的能力，从而在缺血缺氧微环境中维持Type H/R型EC的存活和血管生成功能。体外siRNA敲低PDK4显著损害了HUVECs的增殖、迁移和管形成能力，伴随肉碱类代谢物积累和脂肪酸氧化通量下降。该研究为理解NONFH中血管修复的代谢调控机制提供了新见解，并将PDK4确立为极具前景的干预靶点和分期分子标志物。

今天给大家解读一篇4月发表在《Biology Direct》上的题目为“Single-cell RNA sequencing analysis reveals the evolution and regulatory features of specialized endothelial cell subsets in non-traumatic osteonecrosis of the femoral head.”的文章。本研究采用公共数据库中的单细胞RNA测序数据（SRP361778），包含3例ARCO 3a期NONFH、3例ARCO 4期NONFH和3例髋关节骨关节炎（HOA）对照的股骨头样本。通过标准化处理、聚类和注释，鉴定出14种主要细胞类型，并对内皮细胞进行亚群分析，区分出L型、H型、R型和动脉型内皮细胞。通过拟时序分析、细胞通讯分析、差异基因筛选及蛋白互作网络，锁定PDK4为共同调控H型和R型内皮细胞的关键基因。随后在HUVECs中通过siRNA敲低PDK4，验证了其对增殖、迁移、成管能力的影响，并利用非靶向代谢组学证实PDK4敲低导致脂肪酸氧化受阻（肉碱类代谢物堆积、长链脂肪酸减少）。外周血转录组数据（GSE123568）分析显示PDK4在NONFH不同阶段呈现与单细胞一致的动态表达模式，且具有较好的分期诊断效能（AUC>0.7）。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！

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团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
       
       
       

        
       
       
       

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CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

1. 数据获取与处理
   从SRA数据库获取NONFH和HOA的scRNA-seq数据（9个样本），经质控、降维、聚类后鉴定细胞类型。从GEO数据库获取NONFH外周血转录组数据（40例样本，分早期、中期、晚期和对照）。
2. 内皮细胞亚群鉴定
   基于已知标志基因（PECAM1、EMCN、CD55、RAMP3、AQP1、SEMA3G等）划分四种内皮亚群，分析其比例变化。
3. 功能与轨迹分析
   采用GO/KEGG富集分析、转录因子活性（DoRothEA）、拟时序分析（CytoTRACE、Monocle2）研究各亚群功能和分化关系。
4. 细胞通讯分析
   使用CellChat探讨内皮亚群与其它细胞类型的配体-受体相互作用。
5. 关键基因筛选
   通过差异表达分析（上调于ONFH 3a vs HOA，下调于ONFH 4 vs 3a）并取H型和R型交集，结合高表达筛选，获得8个候选基因，经PPI网络确定PDK4为核心。
6. 功能验证
   在HUVECs中敲低PDK4，检测增殖（EdU）、迁移（Transwell）、成管能力，并利用代谢组学分析脂肪酸氧化变化。
7. 外周血验证
   分析关键基因在NONFH不同阶段外周血中的表达，绘制ROC曲线评估诊断效能。

研究亮点：

1. 首次在人类NONFH股骨头组织中基于单细胞RNA测序系统鉴定了四种特殊内皮细胞亚群，并描绘了其丰度随疾病进展的动态变化。
2. 揭示了H型和R型内皮细胞在NONFH中期（ARCO 3a期）出现代偿性增加，晚期（ARCO 4期）则显著减少，为理解血管修复失败提供了时间维度的证据。
3. 发现PDK4通过代谢重编程（促进脂肪酸氧化）维持H型和R型内皮细胞的功能，并通过体外实验和代谢组学验证了PDK4敲低损害内皮细胞增殖、迁移和成管能力。
4. 整合单细胞与外周血转录组数据，提出PDK4可作为NONFH阶段性外周血分子标志物，有助于无创评估疾病进展。

研究结果：

1. scRNA-seq揭示NONFH中内皮细胞丰度逐渐下降
   共保留69,013个高质量单细胞，鉴定出14种细胞类型；总体内皮细胞比例在ONFH 3a期和4期较HOA组逐渐降低，符合血供减少的病理特征。
2. 鉴定四种特殊内皮细胞亚群
   分为L型（CD55⁺/CTSL⁺/VCAM1⁺）、H型（RAMP3⁺/SELP⁺/TSPAN12⁺）、R型（AQP1⁺/FMO2⁺/APLNR⁺）和动脉型（SEMA3G⁺/GJA4⁺/BMX⁺/VEGFC⁺）。H型和R型细胞在ONFH 3a期比例升高，4期下降，呈动态变化。
3. 功能与分化特征
   H型主要富集细胞粘附通路，R型和动脉型富集血管生成通路；拟时序分析显示H型具有最高分化潜能，向L型分化；PDK4在ONFH 3a期持续高表达于H型和R型。
4. 细胞通讯
   ONFH 3a期基质细胞（脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等）通过COL1A2-整合素、FN1-整合素、APP-CD74等轴与H型、R型内皮细胞相互作用增强，4期减弱。
5. PDK4关键作用
   PPI网络中PDK4连接度最高；虚拟敲除PDK4导致H型中SLC27A4、ADIRF、RPS26、FKBP5等基因扰动，R型中FKBP5、TXNIP扰动，均涉及脂肪酸代谢和应激反应。
6. 体外实验
   PDK4敲低显著降低HUVEC的CPT1A和VEGF-A表达，抑制增殖、迁移和成管；代谢组学显示肉碱及酰基肉碱累积、长链脂肪酸减少、脂肪酸降解和PPAR信号通路下调，证实脂肪酸氧化受损。
7. 外周血表达
   PDK4在外周血中呈现中期升高、晚期下降的模式，与单细胞一致；ROC曲线显示PDK4在区分NONFH各阶段中的AUC均>0.7。

研究总结：

结果译文：

在对NONFH的scRNA-seq数据进行标准化和严格质量控制后，共保留了69,013个高质量单细胞。基于经典细胞标志基因，识别出14种主要细胞类型，包括脂肪细胞、B细胞、经典树突状细胞（cDCs）、软骨细胞、ECs、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、间充质干细胞（MSCs）、中性粒细胞、成骨细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、浆细胞和T/NK细胞（图1A-D）。每种细胞类型的前五个差异表达基因显示于热图中（图1E）。细胞比例分析揭示了不同细胞类型丰度在各组间的显著变化（图1F）。值得注意的是，与HOA组相比，EC在ONFH 3a期和4期中的总体比例和数量均逐渐下降，这与NONFH中股骨头血供减少的病理特征一致。

为研究NONFH中ECs的异质性，我们进一步对ECs进行了聚类分析。考虑到先前的研究提示骨中存在淋巴管及其在骨修复中的潜在作用，我们检验了EC群体中经典淋巴EC标志物的表达。我们发现PROX1、PDPN、LYVE1和CCL21几乎不表达，且未形成独立的细胞簇，而泛血管内皮标志物如PECAM1、EMCN和CDH5则高度表达（图S1A-B）。这些结果表明，本研究分析的EC群体主要由血管内皮细胞组成。随后，基于先前报道的骨特殊血管标志基因，识别出四个EC亚群：Type L、Type H、Type R和动脉EC（图2A-B）。Type L EC展现出PECAM1（CD31）和EMCN的低表达，但CD55、CTSL和VCAM1的高表达；Type H EC特异性表达RAMP3、SELP和TSPAN12；Type R EC表达AQP1、FMO2和APLNR；动脉EC表达经典标志物SEMA3G、GJA4、BMX和VEGFC（图2C-D）。细胞丰度分析揭示，Type H和Type R EC的数量和比例在ONFH 3a期较高，而在4期下降，呈现出一种动态模式（图2E）。每种EC亚群的前五个差异表达基因显示于热图中（图2F）。转录因子调控网络分析揭示了亚群特异性的转录活性（图2G）。GO和KEGG功能富集分析进一步揭示了每种EC亚群的功能特征（图2H-I）。Type L EC在免疫应激和炎症反应相关过程中显著富集，提示其在NONFH相关炎症中的作用。Type H EC主要参与细胞粘附的调控，可能有助于组织修复。Type R和动脉EC均参与血管生成以及细胞增殖和迁移的正向调控，而动脉EC还在负向调控细胞迁移的抑制性通路中显著富集。这些结果提示，NONFH中期Type H和Type R EC丰度的增加可能代表一种重要的病理生理反应，可能介导NONFH中的血管生成和骨修复。

我们进一步研究了NONFH中EC亚群的发育动力学和分化关系。CytoTRACE分析揭示，Type H EC展现出最高的分化潜力，并被视为分化轨迹的起点，而动脉EC作为特殊细胞，展现出相对成熟的分化状态（图3A-B）。随后，使用Monocle2构建了分化轨迹。结果显示，Type H EC的发育方向指向Type L EC，与此前的研究一致（图3C-F）。基于BEAM分析生成的伪时序基因表达热图突显了决定每个细胞簇不同命运的关键基因（图3G）。进一步分析揭示，CD55、SEMA4A和HIF1A在伪时序后期上调，提示在Type L EC发育过程中的潜在作用；CDH5、DACH1和VWF在伪时序早期上调，可能对应于Type H和Type R EC的发育阶段；CXCL12在伪时序中早期上调，指示其在动脉EC发育过程中的潜在功能（图3H）。这些发现表明，NONFH中每种EC亚群遵循一个明确的分化轨迹，具有时间依赖性基因表达模式，为理解它们在血管生成和骨修复中的作用提供了分子基础。

Type H和Type R血管与NONFH中的血管生成和骨修复密切相关，且其丰度在ONFH 3a期增加但在4期减少，这引起了我们的注意。为识别协同调控Type H和Type R EC动态变化的关键基因，首先在这两个亚群中分别进行了差异表达分析。将“ONFH 3a vs HOA”上调且“ONFH 4 vs ONFH 3a”下调的基因取交集，获得了每个亚群的候选基因，再将这两个候选基因集的交集产生了20个共享候选基因（图5A）。进一步筛选在Type H和Type R EC中高表达而在其他内皮亚群中低表达的基因，得到八个关键基因：FKBP5、SLC27A4、TSC22D3、RNF115、KCTD3、SOCS2、PDK4和ABCG2（图5B）。小提琴图显示，这八个关键基因在不同ONFH阶段间的表达趋势与Type H和Type R EC的丰度变化一致（图5C）。随后构建了PPI网络，其中PDK4展现出最高的连接度，并与SLC27A4、TSC22D3、ABCG2、FKBP5和SOCS2存在潜在的相互作用（图5D）。伪时序分析表明，PDK4在ONFH 3a期的两个亚群中均持续高表达（图5E-F）。因此，PDK4被识别为Type H和Type R EC的共享核心基因，可能在维持这些亚群的状态和功能中发挥关键作用。

PDK4是一种代谢调节因子，可在响应微环境变化时抑制葡萄糖利用，将细胞能量代谢转向脂肪酸氧化。SLC27A4是一种参与脂质代谢的长链脂肪酸转运蛋白。考虑到这两个关键基因的潜在协同功能，我们进行了基因功能关联分析，揭示了它们参与脂肪酸转运、脂质代谢调控、葡萄糖代谢、对外部刺激的应答以及乙酰辅酶A合成（图6A）。为进一步评估PDK4的功能，我们对NONFH进展过程中Type H和Type R EC中相关功能基因模块进行了评分。糖酵解评分显示，在ONFH 3a期，Type H和Type R EC中的糖酵解调控显著降低，而氧化磷酸化水平显著升高（图6B）。脂肪酸代谢评分表明，两种EC类型的脂质和脂肪酸代谢活性在ONFH 3a期升高，在4期下降（图6C）。鉴于先前研究将PDK4与铁代谢和血管生成联系起来，我们进一步评估了铁应答和铁死亡抵抗，发现两者在ONFH 3a期的Type H和Type R EC中均显著增强，同时血管生成活性增加（图6D-E）。随后，我们使用scTenifoldKnk算法在Type H和Type R EC中对PDK4进行了虚拟敲除（图6F-G）。在Type H EC中敲除PDK4导致四个基因的显著扰动，包括SLC27A4、ADIRF、RPS26和FKBP5，它们共同参与脂肪酸摄取、脂质代谢调控、蛋白质翻译和细胞应激反应。在Type R EC中，FKBP5和TXNIP两个基因受到显著扰动，主要与细胞应激反应和能量代谢调控相关。这些结果提示，PDK4可能通过代谢重编程维持Type H和Type R EC的功能状态和动态丰度。

尽管NONFH是股骨头的一种局部坏死性疾病，但局部微环境释放的信号分子可能影响外周血中的基因表达。基于单细胞分析鉴定的八个关键基因，在NONFH外周血转录组数据中检测到FKBP5、TSC22D3、RNF115、ABCG2、KCTD3、SOCS2和PDK4等七个基因（图7A）。值得注意的是，TSC22D3和PDK4的表达模式与单细胞数据一致，在疾病中期显示出显著增加，在该阶段达到峰值，然后在晚期下降。进一步评估这些关键基因对NONFH阶段区分的表现，显示PDK4在外周血中具有良好的表现，其在早期、中期和晚期的AUC值均大于0.7，提示其作为NONFH分期的外周分子标志物的潜力（图7B）。PDK4在股骨头ECs和外周血中的分子表达模式高度一致，提示NONFH中局部与全身状态之间存在联系。

为研究PDK4在血管ECs中的作用，使用siRNA敲低了HUVECs中的PDK4（图8A）。RT-qPCR分析显示，PDK4敲低显著降低了与脂肪酸代谢相关的基因CPT1A和与血管生成相关的基因VEGF-A的表达（图8B）。EdU实验证明，PDK4敲低显著抑制了HUVEC增殖（图8C-D）。Transwell实验表明，PDK4敲低显著损害了HUVEC迁移（图8E-F）。管形成实验显示，PDK4敲低减少了连接点数量（图8G-H）。为进一步验证PDK4在内皮脂肪酸代谢中的调控作用，进行了非靶向代谢组学分析。OPLS-DA分析显示si-PDK4和si-NC组之间清晰分离，置换检验确认了模型的稳健性（图8I-J）。与si-NC组相比，多种肉碱相关代谢物在si-PDK4组中显著增加，包括游离肉碱以及酰基肉碱如戊酰肉碱和异戊酰肉碱（图8K-M）。酰基肉碱作为脂肪酸进入线粒体进行β-氧化的关键转运形式，其积累通常表明线粒体脂肪酸氧化通量受损。同时，在si-PDK4组中若干长链脂肪酸显著减少，包括花生四烯酸和硬脂酸（图8N-O），提示细胞内脂肪酸供应减少或代谢通量改变。与此一致，GSEA显示出si-PDK4组中脂肪酸降解、PPAR信号和未饱和脂肪酸生物合成通路呈下降趋势，提示脂肪酸氧化能力受损（图S2A-D）。总体而言，这些结果表明PDK4敲低抑制了HUVECs中的脂肪酸氧化，损害了EC功能，提示其在ONFH 3a期的上调可能对Type H和Type R EC具有保护作用。

更多结果和补充图表：doi： 10.1186/s13062-026-00774-8

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