2区4.3分！外泌体抗衰新突破！蛋白组学生信分析与miRNA测序揭示：COL1A2/COL3A1/TIMP3与Let-7家族共驱动3D重建皮肤真表皮再生与屏障修复- 大数跨境

2区4.3分！外泌体抗衰新突破！蛋白组学生信分析与miRNA测序揭示：COL1A2/COL3A1/TIMP3与Let-7家族共驱动3D重建皮肤真表皮再生与屏障修复

CNS生信新靶点挖掘

2026-04-27

导读：细胞外囊泡是再生医学的明星分子，但其在3D皮肤模型中的抗衰老机制尚未系统阐明。本研究利用脂肪干细胞和脐带间充质干细胞来源的EVs，在T-Skin™全层重建皮肤模型上进行了多组学功效与机制解析。该研究为

细胞外囊泡（EVs）是再生医学的明星分子，但其在3D皮肤模型中的抗衰老机制尚未系统阐明。本研究利用脂肪干细胞（ADSC）和脐带间充质干细胞（UC-MSC）来源的EVs，在T-Skin™全层重建皮肤模型上进行了多组学功效与机制解析。结果显示，两种EVs均显著促进成纤维细胞与角质形成细胞增殖，增加表皮厚度，并上调真表皮连接处胶原IV及真皮原纤蛋白1的表达。bulk RNA-seq揭示EVs显著下调IL6、CXCL8、CCL4等促炎因子及衰老相关基因。miRNA测序与蛋白组学鉴定出Let-7家族、miR-21及COL1A2/COL3A1/TIMP3等关键效应分子。该研究为下一代再生护肤活性成分的开发提供了坚实的科学基础。

今天给大家解读一篇3月发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上的题目为“Extracellular vesicles modulate skin aging biomarkers in a 3D reconstructed full-thickness skin model.”的文章。该研究旨在探索已知具有促再生潜力的细胞外囊泡（EVs）在3D重建皮肤模型中是否能调节与皮肤衰老相关的生物标志物。研究者从脂肪干细胞（ADSC）和脐带间充质干细胞（UC-MSC）中分离EVs，在2D成纤维细胞增殖实验和3D全厚度皮肤模型（T-Skin™）中进行效能评估。检测指标包括表皮厚度、角质形成细胞增殖、IV型胶原和fibrillin 1等衰老相关蛋白的表达。同时，通过3D模型的转录组分析，结合EVs自身的miRNA和蛋白质组学分析，探索其作用机制。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！

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题目：《细胞外囊泡在三维重建全厚度皮肤模型中调节皮肤老化生物标志物》Extracellular vesicles modulate skin aging biomarkers in a 3D reconstructed full-thickness skin model

发表期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

影响因子：4.3

研究背景：

EVs的再生潜力
细胞外囊泡（EVs）是富含miRNA、蛋白质和脂质的纳米囊泡，是细胞间通讯的重要介质。已有研究表明，来自多种干细胞的EVs在2D和临床前模型中显示出促再生潜力，可促进伤口愈合、抑制细胞衰老等。
研究缺口
尽管已有证据，但EVs对3D重建皮肤模型中皮肤再生和衰老过程的影响研究尚不充分。传统2D实验缺乏细胞间相互作用和三维结构评估，动物模型难以完全模拟人类皮肤生理。因此，需要更接近人体生理的模型来阐明EVs的功效和作用机制。
研究目的
利用3D重建全厚度皮肤模型，系统评估ADSC-EVs和UC-MSC-EVs对皮肤再生和衰老关键标志物的影响，并通过转录组、miRNA和蛋白质组学分析揭示其作用机制。

CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点

研究思路：

EVs制备与表征
从ADSC和UC-MSC细胞培养上清中分离EVs，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、冷冻电镜（Cryo-TEM）和Western blot检测标志物（TSG101、HSP70、CD63、calnexin）进行表征。
2D细胞活性验证
在正常人成纤维细胞（NHF）中测试EVs对增殖的影响，并通过荧光标记（CM-Dil）观察EVs的细胞摄取。
3D皮肤模型效能评估
将EVs（高、低两个浓度）添加到培养的重建全厚度皮肤模型（T-Skin™）中，利用光学相干断层扫描（OCT）、H&E染色评估表皮厚度和形态，通过免疫荧光染色检测角质形成细胞增殖（Ki67）、DEJ完整性（IV型胶原）和胞外基质（fibrillin 1）的表达。
机制探索
对经EVs处理的3D皮肤模型进行全转录组测序（bulk RNA-seq），分析差异表达基因（DEGs）及富集的信号通路。同时，对ADSC和UC-MSC EVs本身进行miRNA测序和蛋白质组学分析，鉴定其携带的功能性miRNA和蛋白质。
交叉分析
将EVs中高表达的miRNA预测靶基因与3D模型中的DEGs进行重叠分析，寻找潜在的关键调控因子。

研究亮点：

模型创新
采用体外3D全厚度重建皮肤模型（T-Skin™），相较于传统2D细胞实验更能模拟人体皮肤生理结构和细胞间相互作用，同时避免了动物模型的种属差异。
多组学整合
将3D模型的转录组（RNA-seq）与EVs的miRNA-seq和蛋白质组学分析相结合，通过交叉对比筛选出可能介导生物活性的关键分子（如miRNA和蛋白），为机制解析提供了多层次证据。
来源比较
同时评估了ADSC-EVs和UC-MSC-EVs，揭示了两种来源EVs在促进皮肤再生方面的共性（如增加表皮厚度）和差异（如UC-MSC-EVs在调节免疫相关基因方面更显著）。

研究结果：

EVs表征
ADSC和UC-MSC EVs平均粒径在125-130 nm，呈典型杯状结构，表达阳性标志物（TSG101、HSP70、CD63）且不表达阴性标志物calnexin，符合MISEV2023指南标准。
2D细胞实验
ADSC-EVs在所有测试浓度（3×10⁸至1×10¹⁰ particles/mL）下均显著促进成纤维细胞增殖，UC-MSC-EVs在1×10⁹ particles/mL及以上浓度时效果显著。同时，两种EVs均能被成纤维细胞有效摄取。
3D皮肤模型效果

表皮厚度
OCT和H&E结果显示，两种EVs在高低浓度下均显著增加皮肤模型的表皮厚度和活细胞层厚度。EVs处理组的基底层角质形成细胞呈现更明显的增殖和极化形态。
角质形成细胞增殖
免疫荧光显示，两种EVs均显著提高表皮基底层Ki67阳性细胞的比例（约1.6-2倍）。
DEJ与胞外基质
高浓度ADSC和UC-MSC EVs显著增强DEJ处的IV型胶原表达（约45%）。ADSC EVs在低浓度下显著增加真皮中fibrillin 1的表达（约49%），并使其呈现更长的纤维状结构。

转录组分析

两种EVs处理后，3D模型中分别有142和159个基因在两个浓度下共同差异表达。
富集通路
两类EVs均显著富集了与皮肤发育、上皮发育、角质形成细胞分化和细胞-细胞粘附相关的GO条目。
抗炎作用
UC-MSC-EVs显著富集了与细胞因子信号和免疫应答相关的GO条目，并下调了促炎基因IL6、IL33、CXCL8、CCL4等的表达。ADSC-EVs也显示了类似趋势。

miRNA和蛋白质组分析

miRNA
鉴定了大量miRNA，其中Let-7a-5p、Let-7c-5p、miR-16-5p等共有高表达miRNA。对这些miRNA的靶基因预测与DEGs交叉分析，得到33个共有基因，包括与角质化、细胞粘附（CLDN17、CDH2）及免疫（IL6、CXCL8）相关的基因。
蛋白质
鉴定出1054种共有蛋白。ADSC EVs中显著高表达COL1A2、COL3A1、TIMP3等与皮肤发育、ECM组织和细胞-基质粘附相关的蛋白。

研究总结：

结论：

功效验证
来自ADSC和UC-MSC的EVs能够在3D重建全厚度皮肤模型中调节与皮肤衰老相关的生物标志物。具体表现为促进表皮增厚和角质形成细胞增殖，增强DEJ的IV型胶原和胞外基质fibrillin 1的表达，表明其具有促进皮肤再生的潜力。
机制洞察
通过多组学分析，EVs的促再生作用可能源于其携带的特定miRNA（如Let-7家族、miR-21）和蛋白质（如STAT3、TIMP3），它们共同调控了与细胞增殖、皮肤发育、细胞粘附以及抗炎相关的基因表达网络。UC-MSC-EVs在调节免疫相关基因方面表现更为突出。
模型价值
该研究证明了3D重建皮肤模型是评估EVs等活性成分功效和机制的有力工具，能够弥补2D实验和人体临床研究之间的鸿沟，具有高重复性和高通量优势。

讨论：

优势与局限
3D模型虽比2D更接近生理状态，但仍无法完全模拟真实皮肤的复杂性（如免疫细胞多样性和全身性过程）。因此，关键发现仍需通过临床研究进行验证。
EVs的复杂性
EVs的生物效应可能由多种miRNA和蛋白质协同驱动，而非单一分子。本研究观察到的增殖反应呈平台期而非线性依赖，也反映了EV信号传导的复杂性。
来源差异与标准化
ADSC和UC-MSC EVs在功能上有重叠亦有差异，但EVs的功能受细胞来源、培养条件、分离方法等多种因素影响。研究使用的EVs来自单一供应商，结果不能外推到所有来源的同类EVs，必须遵循标准化流程进行个体评估。
应用前景
该研究为开发下一代含EVs的再生护肤活性成分奠定了基础。3D皮肤模型为化妆品行业（尤其在欧洲禁止动物实验的背景下）提供了可靠的替代测试方案。未来需聚焦于EV的生产放大、货物协同作用机制研究以及临床转化。

结果译文：

1.从ADSCs和UC-MSCs分离的EVs的表征

依据MISEV2023指南对从ADSC和UC-MSC细胞上清液中获得的EVs进行表征（图1）。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定EVs的尺寸，ADSC EVs的平均尺寸为125±5 nm，UC-MSC EVs为130±7 nm，两者主要分布于60-200 nm范围内（图1a），与先前报道一致。此外，利用透射电子显微镜（TEM）观察EVs的形态，显示ADSC和UC-MSC EVs均呈圆形和杯状结构。这些EVs表现出完整的膜结构，直径尺寸范围与NTA检测结果相似，约为100-200 nm（图1b）。为进一步验证EV身份，使用Western blotting确认了特定EV蛋白标志物的存在，包括TSG101、HSP70和CD63。结果显示，ADSC EVs和UC-MSC EVs表达阳性标志物TSG101、HSP70和CD63，这也在细胞裂解物（CL）组的表达中得到证实。阴性标志物calnexin应在细胞裂解物中表达，但在ADSC EVs和UC-MSC EVs中未表达（图1c）。这三种阳性标志物的存在以及阴性标志物calnexin的缺失确认了EV的身份。

2. ADSC EV和UC-MSC EV对2D成纤维细胞的作用

在2D培养板上培养的正常人成纤维细胞分别接受ADSC EVs和UC-MSC EVs处理，以研究EVs对成纤维细胞增殖的影响。表皮生长因子（EGF）作为阳性对照，刺激了浓度依赖性的细胞增殖增加（图2a），与先前报道的结果一致。细胞外囊泡的施加终浓度范围为3×10⁸颗粒/mL至1×10¹⁰颗粒/mL。结果显示，在所有测试浓度下，ADSC EV添加后成纤维细胞增殖均较阴性对照（2% FBS）显著增强。值得注意的是，1×10¹⁰颗粒/mL的ADSC EVs处理导致细胞增殖增加37%，较低测试浓度下观察到相对于对照约18%的增加（图2b）。UC-MSC EVs在浓度为1×10⁹颗粒/mL及以上时刺激成纤维细胞增殖，在最高测试浓度（1×10¹⁰颗粒/mL）下达到23%的增加。与ADSC EVs不同，3×10⁸颗粒/mL的UC-MSC EVs未产生细胞增殖的增加（图2c）。

为可视化EVs是否被成纤维细胞内化，将EVs用亲脂性荧光染料DiL标记，与成纤维细胞共孵育最长12小时。在不同时间点捕获的图像揭示了成纤维细胞对EVs的摄取，ADSC和UC-MSC EVs在12小时时均被细胞内化（图2d,e）。代表性视野的图像分析表明，约51%和45%的成纤维细胞群分别显示出可检测的ADSC-EVs和UC-MSC-EVs核周共定位。这为EV-细胞相互作用提供了定性和半定量证据，为本研究中观察到的再生应答提供了机制基础。

3.ADSC EV和UC-MSC EV对3D皮肤重建模型的作用

为检测EVs在重建皮肤系统中的生物活性，向全层重建皮肤模型（T-Skin™）的培养基中加入ADSC EVs和UC-MSC EVs。在本研究中，EVs以1×10⁹颗粒/mL的高测试浓度和1×10⁸颗粒/mL的低浓度进行应用。EV处理自模型从气-液界面提升后的第15天开始。在第18天更换含指定处理物的培养基并再孵育3天。第21天收获模型用于各种分析，包括OCT成像、H&E染色和免疫荧光染色（图3a,b）。

评估皮肤模型内表皮层的厚度并以未处理组为基准进行标准化。应用维生素C作为阳性对照，导致全层表皮厚度显著增加（图3c）。当接受ADSC EVs和UC-MSC EVs处理时，两种EV浓度下模型均表现出表皮厚度的显著增加（图3c,e）。由于OCT图像涵盖包括角质层在内的整个表皮，因此进行H&E染色以可视化表皮的不同层次。模型展示出界限清晰的表皮主要层次，即基底层（SB）、棘层（SS）、颗粒层（SG）和角质层（SC）（图3d），如前所述。测量了活细胞层的厚度，显示EV处理后显著增加（图3f）。此外，如图3d中黄色箭头所示，表皮的基底层表现出更高程度的增殖和极性，其特征为拉长的柱状基底角质形成细胞垂直于真表皮连接（DEJ）排列，而未处理组中观察到的是立方状基底角质形成细胞。

表皮基底层中增殖的角质形成细胞通过Ki67抗体免疫染色可视化，Ki67是细胞增殖的关键标志物。定量了表皮活细胞层中Ki67阳性角质形成细胞的比例，并进一步计算了基底层中Ki67阳性细胞比率。重建皮肤模型显示，高剂量和低剂量ADSC EV处理分别使表达Ki67的角质形成细胞增加了两倍和1.9倍。UC-MSC EVs处理同样使Ki67表达在高浓度下增加1.8倍，低浓度下增加1.6倍（图4a）。表皮内发生的时空分化过程通过分化生物标志物filaggrin的定位反映出来，EV处理与否其表达未呈现显著差异（补充图S1）。

DEJ生物标志物胶原IV是连接两层皮肤并发挥重要调控功能的蛋白质和蛋白聚糖复杂网络的组成部分，也在EV处理后进行了检测。T-skin模型中胶原IV的表达在200 μM维生素C处理后首先被测量，结果显示与未处理对照相比显著增加49%。来自ADSCs和UC-MSCs的EVs处理的模型均表现出显著升高的胶原IV表达。胶原IV表达通过图像分析进行半定量，显示ADSC EVs和UC-MSC EVs高浓度处理下增加了45%。对于低浓度测试的ADSC EVs和UC-MSC EVs，观察到26%的增加，但未达到统计学显著性。

还评估了原纤蛋白1，它是一种结构糖蛋白，原弹性蛋白分子附着于其上，在真皮层中形成弹性纤维。T-skin中原纤蛋白1的表达在200 μM维生素C处理后进行测量，结果显示与未处理对照相比显著增加36%，与先前报道一致。在10⁸颗粒/mL浓度下，ADSC EVs使原纤蛋白1表达显示49%的增加，而10⁹颗粒/mL浓度下的效应幅度似乎较弱（增加23%，相对于溶剂对照p=0.055）。观察到UC-MSC EV组在10⁹颗粒/mL（p=0.26）和10⁸颗粒/mL（p=0.20）浓度下原纤蛋白1表达的升高（图4f）；然而，这些增加不具有统计学显著性。值得注意的是，EV处理组织的原纤蛋白1表达展示出更为拉长的纤维样结构，而对照组织中则以点状模式为主（图4e），尽管其生理意义仍不清楚。

4.利用转录组学分析解码ADSC和UC-MSC EV促进皮肤再生的机制

为阐明T-skin模型在ADSC EVs和UC-MSC EVs处理后的潜在分子机制，将样品裂解并加工用于bulk转录组学分析。通过将EV处理组（高浓度和低浓度）与未处理皮肤模型进行比较，评估了差异基因表达。由于即使在相同来源的不同EV浓度之间也观察到变异性，因而采用了一种严格的方法：仅将在高浓度和低浓度EV下均持续差异表达的基因纳入考虑，以确定每个EV处理组的稳健转录组学特征（补充图S2）。该比较分析鉴定出一组差异表达基因（DEGs），Q值<0.05，其中在ADSC EV和UC-MSC EV条件下分别有142和159个基因在EV处理组和对照组之间表现出至少两倍的表达变化（火山图，图5a,b）。这些DEGs的独特表达模式通过标准化表达值的热图进一步可视化，清晰展示了实验组之间的差异（图5a,b）。

对差异表达基因中最显著富集的通路进行概览见图5c,d和补充表S1-S3。在两种比较中，与皮肤和上皮发育及角质形成细胞分化相关的基因本体（GO）条目有显著的富集。这些发现与本文第3.3节先前描述的结果一致。此外，我们还能突出与细胞间黏附相关的GO条目的显著富集。这伴随着多个参与皮肤连接的基因的调节，例如紧密连接蛋白CLDN17和CLDN3的表达增加，以及CDH2（N-钙黏蛋白）和DLG2（这些是细胞连接组织和极性的关键参与者）的差异表达（补充表S2-S3）。总体而言，这些发现表明受试EVs可能通过影响对细胞黏附和细胞骨架组织至关重要的通路来增强皮肤屏障完整性。

进一步的通路富集分析揭示了UC-MSC EV条件下与细胞因子信号和免疫应答相关的GO条目的显著富集（图5d；补充表S3）。值得注意的是，多个参与炎症和免疫通路的核心基因在UC-MSC EV处理后差异表达。例如，IL6和IL33这两个参与介导炎症反应的关键细胞因子均下调。对免疫细胞募集和活化重要的趋化因子如CXCL8和CCL4也显示表达降低。此外，编码参与免疫细胞运输和调节的趋化因子受体的基因如CXCR4和ACKR3显著下降。相比之下，ADSC EV条件下的通路富集分析未识别出与细胞因子信号或免疫应答相关的GO条目的显著富集。然而，通过人工检查表达数据，UC-MSC EV条件中突出的几个基因在ADSC EV处理后也展示出降低的表达（补充表S2-S3）。这些基因可能因其倍数变化值低于设定阈值而被排除在富集分析之外。总之，这些发现表明UC-MSC和ADSC来源的EVs可能在调节皮肤模型中细胞因子信号和免疫相关过程中发挥作用，尽管该效应在UC-MSC EVs中似乎更为显著。

5. ADSC EVs和UC-MSC EVs的Micro RNA-seq和蛋白质组学分析

为进一步研究EVs在皮肤细胞模型中观察到的功效背后的机制，我们进行了ADSC和UC-MSC EVs中功能性生物组分的全面表征，特别关注它们的miRNA和蛋白质含量。尽管miRNA仅占EVs内RNA货物的一小部分，但已知它们在调节靶细胞功能中发挥重要作用。我们的分析鉴定出ADSC EVs中的736个miRNAs和UC-MSC EVs中的1,137个miRNAs。其中，686个miRNAs为两种EV类型共有（图6a）。基于相对表达水平确定了每种EV类型中表达最丰富的前10个miRNAs（图6b）。几个高表达miRNAs——特别是Let-7a-5p、Let-7c-5p、Let-7f-5p、miR-16-5p和miR-199b-3p——在两个EV群体之间共享。为进一步探索这些共享miRNAs介导的潜在功能，对它们的662个共有miRNAs进行了聚类分析，以预测它们在人类细胞中的推定靶基因。然后将这些预测的靶基因与先前鉴定的DEGs进行交叉引用，得到图6c所示的33个基因的子集。值得注意的是，在这33个基因中，有几个与第3.4节先前描述的关键皮肤功能相关，包括参与表皮角化和发育以及细胞间黏附的基因，如CLDN17和CDH2。此外，该列表也包括参与免疫应答和炎症的基因，例如IL6和CXCL8。

ADSC和UC-MSC EVs的蛋白质组学分析显示，1,054个蛋白质存在于两种类型的EVs中（图6d）。这1,054个共有鉴定蛋白质中近五分之一参与细胞内信号级联或受体结合，相当比例的鉴定蛋白质共同涉及炎症反应、脂质和囊泡介导的运输、翻译以及细胞骨架组织。EVs中约10%的检测蛋白质与细胞黏附、蛋白质折叠、大分子复合物组装和有机物相关。较小的子集（5%）参与细胞稳态、蛋白水解、凋亡、蛋白质定位等功能的调节。根据相对丰度对蛋白质进行排序，数个蛋白质同时出现在ADSC和UC-MSC EVs的前10位中，包括α-2-巨球蛋白（A2M）、补体成分3（C3）、肌动蛋白（ACTB）、免疫球蛋白重链（IGHM）和白蛋白（ALB）。与UC-MSC EVs相比，ADSC EVs展示出73个差异表达蛋白质，包括COL1A2、COL3A1、TIMP3等蛋白质的显著更高表达（图6f）。这些蛋白质与皮肤发育、细胞外基质（ECM）组织、细胞-基质黏附相关的通路有关，这可能是观察到的生物活性差异的原因。

更多结果和补充图表：doi： 10.3389/fcell.2026.1784998

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