今天给大家解读一篇4月发表在《iScience》上的题目为“Small RNA sequencing identifies serum tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA levels as a biomarker for survival in amyotrophic lateral sclerosis.”的文章。本研究是一项探索性研究，旨在发现ALS中随时间变化的小非编码RNA（sncRNA）生物标志物。通过对一个包含40名ALS患者的发现队列的116份纵向血清样本进行小RNA测序，研究筛选出tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA作为随时间升高最显著的sncRNA。随后，该发现通过TaqMan PCR在发现队列和另一个由35名患者组成的独立验证队列中得到验证。研究结果证实，tDR-1:34-Gly-GCC水平与生存期呈负相关，表明其作为预后生物标志物的潜力，并且其水平独立于性别、发病部位和年龄。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《小RNA测序鉴定血清tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA水平为肌萎缩侧索硬化症生存期的生物标志物》Small RNA sequencing identifies serum tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA levels as a biomarker for survival in amyotrophic lateral sclerosis
发表期刊：iScience
影响因子：4.1
研究背景：
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，患者生存期差异极大（从数月到超过10年），这给预后判断和临床试验设计带来了巨大挑战。尽管已开发出基于临床特征的预后模型，以及神经丝轻链（NfL）等“湿性”生物标志物，但对ALS表型变异性的理解仍不完整，迫切需要新的生物标志物。小非编码RNA（sncRNA）作为一类相对新颖的生物标志物，因其在生物液体中的稳定性而具有潜力。本研究采用无偏倚的方法，通过小RNA测序来检测ALS患者中多种sncRNA随时间的变化。
研究思路：
- 发现阶段
对一个由40名ALS患者组成的发现队列，在诊断时（T1）、诊断后3-4个月（T2）和6-8个月（T3）三个时间点收集血清样本。使用小RNA测序技术（RNA-seq）对所有样本进行全转录组水平的sncRNA表达谱分析。 - 筛选与验证
通过差异表达分析，筛选出随疾病进展显著变化的sncRNA，并基于统计显著性和表达量，选择tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA作为最有潜力的候选标志物。随后使用TaqMan PCR技术在发现队列中对该结果进行验证。 - 独立重复
在另一个由35名患者组成的独立验证队列（包含两个时间点的样本）中，重复验证tDR-1:34-Gly-GCC的纵向增加趋势。 - 临床关联分析
使用联合模型分析血清tDR-1:34-Gly-GCC水平与患者生存期的关系，并分析与性别、发病年龄、发病部位、疾病进展速率（ALSFRS-R评分）等临床参数的相关性。同时，还检测了血管生成素（ANG）和NfL的水平，并分析它们与tDR-1:34-Gly-GCC的相互关系。
研究亮点：
- 纵向动态变化
该研究首次在纵向血清样本中观察到tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA水平随着ALS疾病进展而显著增加。 - 预后价值明确
单变量和联合模型分析均证实，较高的tDR-1:34-Gly-GCC水平与患者较短的生存期显著相关（HR: 1.65; 95% CI: 1.05–5.02）。 - 机制相关性强
研究将其与ALS中已知的异常应激信号传导和蛋白质翻译控制联系起来，认为该生物标志物是神经元应激反应的生物学读数。 - 独立于现有标志物
tDR-1:34-Gly-GCC与神经丝轻链（NfL）水平无相关性，表明两者可能是独立反映不同生物学过程（神经元应激 vs. 神经退行性变）的生物标志物。
研究结果：
- tDR-1:34-Gly-GCC的纵向增加
小RNA测序分析发现，tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA是随时间增加最显著的sncRNA（log2 fold change: 1.22, p-value: 9.88×10⁻⁸）。qPCR验证结果一致，在发现队列中，每增加一年，其表达水平平均增加0.5倍（b = 0.5, p = 0.009）；在验证队列中，平均增加0.9倍（b = 0.9, p = 0.01）。该增加独立于性别、发病部位和年龄。 - 与生存期的关联
在联合模型中，较高的tDR-1:34-Gly-GCC水平与较短的生存期显著相关（HR: 1.65; 95% CI: 1.05–5.02）。但在线性混合模型中，未发现其与ALSFRS-R评分的下降速率有显著相关性（estimate = 0.003, p = 0.93）。 - 与血管生成素（ANG）的关系
血清ANG蛋白水平也随时间有轻微但统计学上显著的增加（b = 0.038, p = 0.013），但与tDR-1:34-Gly-GCC水平没有相关性。研究表明，tDR-1:34-Gly-GCC水平作为ANG活性的读数，比ANG本身具有更好的预后价值。 - 与神经丝轻链（NfL）的关系
NfL水平同样与较短的生存期相关（HR = 1.005, 95% CI: 1.003–1.007; p < 0.001），但NfL与tDR-1:34-Gly-GCC水平之间没有相关性，表明它们是独立的预后预测因子。
研究总结：
- 主要结论
血清tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA水平是ALS患者一个有前景的生存期生物标志物，并可能作为临床试验的潜在结局指标。其与较短生存期的负相关性表明它反映了神经元的应激状态。 - 机制讨论
-
tiRNA的形成依赖于血管生成素（ANG）的核糖核酸酶活性，本研究在散发型、延髓型和脊髓型ALS患者中均观察到tDR-1:34-Gly-GCC水平升高，支持了ANG在ALS发病中的作用。 -
ALS的病理生理学被认为是一个多步骤过程，涉及神经元应激的累积。tiRNA在细胞应激反应中发挥关键作用，因此血清中tDR-1:34-Gly-GCC水平的升高可能是神经元应激的生物学读数。研究假设，生存期较短的患者可能承受更强的神经元细胞应激，从而导致更高的tDR-1:34-Gly-GCC水平。 -
tDR-1:34-Gly-GCC与NfL水平无相关性，提示两者反映了不同生物学过程（细胞应激 vs. 神经退行性变），可作为互补的生物标志物。 - 研究局限
-
作为一项探索性研究，样本量相对较小。 -
验证队列仅有2个时间点的数据。 -
研究排除了诊断后生存期小于6个月的患者，可能影响生物标志物与生存期关联的强度。 -
tDR-1:34-Gly-GCC的来源尚不明确，可能来自神经元、肌肉或激活的小胶质细胞/炎症通路。 -
使用外源spike-in控制提取效率，但无法校正生物输入的变异性。 - 未来方向
需要在更大的队列中进行进一步验证，并探索其在脑脊液中的水平。
结果译文：
1.研究参与者的基线特征
描述性特征见表1。比较我们的队列，发现队列平均年龄稍年轻（p=0.006），且C9orf72携带者数量略多（无统计学显著性）。ALSFRS-R斜率的变异性更大，而延髓起病区域、生存期和其他参数具有可比性。所有经过基因检测的患者均未携带ANG突变。本研究的重点是个体患者内随时间的变化值，因此队列间的年龄差异不被视为分析的相关因素。
2.RNA测序——选择tDR-1:34-Gly-GCC作为潜在生物标志物
差异表达分析显示，几个小核仁RNA和tiRNA出现显著的纵向升高，其中基于统计学显著性和表达量，选择tDR-1:34-Gly-GCC tiRNA作为最有前景的候选物（图1A）。tiRNA是通过血管生成素蛋白在其反密码子环处切割转移RNA而产生的，长度为30-40个核苷酸。
3.通过qPCR验证tDR-1:34-Gly-GCC的纵向升高
接下来，我们使用基于TaqMan的PCR分析验证了小RNA测序结果，该方法也可在常规生化实验室中进行。批内变异极小，变异系数值约为3%，批间变异显示变异系数值为7-9%。测得的最低浓度远高于定量下限。在发现队列和验证队列中，我们均检测到在疾病进展过程中tDR-1:34-Gly-GCC水平的纵向升高，每增加一年，发现队列中平均增加0.5倍（b=0.5，p=0.009），验证队列中平均增加0.9倍（b=0.9，p=0.01），如图2所示。需要注意的是，由于倍数变化是使用2^-ΔΔCT方法计算的，即使绝对倍数变化值小于1，时间变量的正估计值也反映tDR-1:34-Gly-GCC表达随时间增加。值得注意的是，在联合模型中，较高的tDR-1:34-Gly-GCC水平与较短的生存期相关（HR：1.65；95% CI：1.05-5.02）。tDR-1:34-Gly-GCC的纵向升高与性别、起病部位和起病年龄无关。虽然tDR-1:34-Gly-GCC水平是生存期的预测因子，但我们未发现其与通过ALSFRS-R评分下降（估计值=0.003，p=0.93）或ALSFRS-R斜率（估计值=-0.066，p=0.81）表达的疾病进展速率存在相关性，这些评估使用线性混合模型进行。
4.血管生成素随时间纵向升高
tiRNA是通过核糖核酸酶血管生成素在细胞应激条件下切割转移RNA而产生的。因此，我们接下来探讨了在我们主要为散发性ALS的队列中，血管生成素水平是否也随疾病进展而升高。我们注意到血管生成素血清蛋白水平随时间有轻度但统计学显著性的升高（b=0.038，p=0.013）（图3）。然而，血管生成素与tDR-1:34-Gly-GCC之间无相关性。未发现与性别、起病年龄、起病部位、突变状态、生存期或进展率有显著相关性。这些发现表明，作为血管生成素活性的读数，血清中tDR-1:34-Gly-GCC水平比血管生成素血清水平本身具有更高的预后价值。
5.神经丝轻链水平
我们最后想探究tDR-1:34-Gly-GCC是否也与NfL水平相关，NfL是目前唯一被广泛接受的生物标志物。批内变异CV值为3.9%，批间变异CV值为2.4%，均极小。由于NfL不呈正态分布，我们应用对数转换以近似正态分布。在单变量模型中，NfL与较短的生存期相关（HR=1.005，95% CI：1.003-1.007；p<0.001）。NfL随时间略有增加（b=0.053，p=0.024），并且在校正性别、起病部位和起病年龄的多变量模型中，与ALSFRS-R斜率呈相关性（b=0.36，p=0.02）。NfL与tDR-1:34-Gly-GCC水平无相关性。因此，NfL和tDR-1:34-Gly-GCC是生存期的独立预测因子，这可能是因为它们代表了不同的生物学过程（神经退行性变 vs. 细胞应激）。
更多结果和补充图表：doi： 10.1016/j.isci.2026.115636
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