术后复发是局部晚期黑色素瘤患者的噩梦，尤其对于亚洲高发的肢端亚型，PD-1单药辅助疗效有限。这项前瞻性II期临床试验首次探索了“抗血管生成+免疫检查点抑制”的联合辅助策略——重组人血管内皮抑制素（恩度）联合特瑞普利单抗。43例III期患者1年无复发生存率达74.4%，中位RFS为27个月。研究更创新性地对7例患者的14份配对血样进行了单细胞RNA/TCR/BCR测序，系统揭示了联合治疗的免疫重塑全景：循环CD8+效应记忆T细胞和效应T细胞比例及TCR克隆多样性显著增加，NK细胞毒性增强，B细胞抗原提呈能力提升，非经典单核细胞比例升高。研究还在两个独立真实世界队列中验证了NLR和CD8+Tem作为疗效预测生物标志物的价值。这为亚洲黑色素瘤患者的术后辅助治疗提供了全新策略和机制洞见。
今天给大家解读一篇4月发表在《Molecular Cancer》上的题目为“Adjuvant recombinant human endostatin combined with toripalimab (anti-PD-1) in locally advanced melanoma: an exploratory phase 2 clinical trial incorporating single-cell RNA/TCR/BCR sequencing.”的文章。这是一项探索性II期临床试验，纳入局部晚期黑色素瘤患者，在手术切除后给予重组人内皮抑素联合托匹利单抗的辅助治疗方案。研究同时在治疗前后采集肿瘤或外周血样本，进行单细胞RNA测序、T细胞受体（TCR）测序和B细胞受体（BCR）测序，以解析联合治疗对肿瘤免疫微环境的影响。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《辅助使用重组人内皮抑素联合托匹利单抗（抗-PD-1）治疗局部晚期黑色素瘤：一项结合单细胞RNA/TCR/BCR测序的探索性II期临床试验》Adjuvant recombinant human endostatin combined with toripalimab (anti-PD-1) in locally advanced melanoma: an exploratory phase 2 clinical trial incorporating single-cell RNA/TCR/BCR sequencing
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：33.9
研究背景：
局部晚期黑色素瘤术后复发风险较高，辅助治疗是降低复发的重要手段。抗PD-1单药辅助治疗已有一定疗效，但仍有部分患者耐药或复发。重组人内皮抑素可通过抑制血管生成改变肿瘤微环境，理论上可与免疫治疗协同。然而，其联合抗PD-1在辅助治疗中的有效性及机制尚不明确。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 临床设计
开放标签、单臂或随机（标题未明确），评价重组人内皮抑素联合托匹利单抗在局部晚期黑色素瘤术后辅助治疗中的安全性和初步疗效。
- 生物信息学整合
对治疗前后的样本进行单细胞RNA/TCR/BCR测序，分析免疫细胞亚群、克隆扩增、抗原特异性等变化，探索与临床应答相关的免疫特征。
研究亮点：
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首次在辅助治疗阶段将重组人内皮抑素（抗血管生成药物）与PD-1抑制剂托匹利单抗联合应用于局部晚期黑色素瘤。
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研究设计中纳入单细胞RNA/TCR/BCR测序，从转录组和免疫组库层面探索联合治疗的免疫微环境动态变化。
研究结果：
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可能观察到联合治疗组患者的无复发存活率或总生存率优于历史数据。
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单细胞测序或揭示治疗后肿瘤微环境中CD8+ T细胞活化增加、血管生成相关信号下调、TCR/BCR克隆多样性改变等免疫重塑特征。
研究总结：
该探索性试验初步证明了重组人内皮抑素联合托匹利单抗在局部晚期黑色素瘤辅助治疗中的可行性与潜在价值，并通过单细胞多组学测序为联合治疗的免疫微环境调控机制提供了分子证据。但受限于样本量和单臂设计，结论需后续III期随机对照试验验证。
结果译文：
研究流程图见图1A。2021年10月至2023年12月间，43例符合条件的患者被前瞻性入组并接受联合辅助治疗。随访持续至2025年6月15日。试验参与者的基线人口学特征汇总于图1B。虽然方案允许纳入寡转移IV期患者，但最终无此类病例入组，可能由于该亚组患者对原发灶和远处器官转移灶根治性切除的接受率较低。因此，最终研究队列完全由III期黑色素瘤患者组成。
关于疗效，1年无复发生存率为74.4%，中位RFS为27个月（95% CI：19，未达到）（图1C）；1年无远处转移生存率为83.1%，中位DMFS未达到（图1D）；1年总生存率为97.6%，中位OS尚未成熟（图1E）。
共35例患者（35/43，81.4%）经历至少一次TRAE，8例（18.6%）无TRAE。贫血（12/43，27.9%）、肝酶升高（11/43，25.6%）和甲状腺功能障碍（9/43，20.9%）是最常见的三种TRAE（表S1，图1F）。
共发生7例3级TRAE（表S1），包括中度贫血（n=1），经促红细胞生成素联合静脉铁剂治疗后缓解；谷丙转氨酶升高（n=1），经甘草酸治疗后消退；甲状腺功能减退（n=2），经左甲状腺素钠替代治疗后改善；皮疹（n=1），经局部强效糖皮质激素霜剂后消退；中性粒细胞减少（n=1），经皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子后恢复正常；急性肾损伤（n=1，表现为血清肌酐升高），经口服泼尼松治疗后缓解。所有3级TRAE在对症干预后均缓解，患者在短暂暂停辅助治疗后成功恢复后续治疗。
两例患者经历4级TRAE并随后停止辅助治疗——1例因心肌炎，另1例因肾功能损害（图1G）。经过两个周期辅助治疗后，患者P35出现心悸和胸痛的心血管症状。外周血检测显示高敏心肌肌钙蛋白T浓度升高至0.363 ng/mL。超声心动图显示新发心包积液。鉴于上述临床和影像学证据，高度怀疑免疫相关性心肌炎。立即停用特瑞普利单抗和恩度，并启动糖皮质激素冲击治疗。经过两周对症治疗，患者心肌炎相关临床表现显著改善，整体临床状况趋于稳定。经过三个周期辅助治疗后，患者P40出现大量蛋白尿和低蛋白血症，导致停止辅助治疗。随后给予糖皮质激素治疗和静脉输注人血白蛋白。肾功能相关临床症状得到显著缓解。
共收集并测序了7例患者辅助联合治疗前后的14份配对血样。经过质量控制（图S1A），共鉴定出95，466个细胞，代表8种细胞类型：浆细胞、B细胞、T和自然杀伤细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核吞噬细胞、浆细胞样树突状细胞和红细胞（图2A）。记录了这些细胞的样本来源（图2B）和分组分配（图2C）。鉴定这些细胞类型的经典标志基因见图2D。每种细胞类型的前10个差异表达基因被鉴定（图S1B）。
免疫细胞比例变化超过基线±10%被定义为增加或减少。总体上，与治疗前水平相比，治疗后中性粒细胞比例降低，而淋巴细胞（包括T细胞和NK细胞）比例增加（图2E和图S1C）。患者P34、P35、P37和P40在治疗后T和NK细胞比例增加，而患者P36、P38和P39未见增加（图2F）。T和NK细胞水平增加患者的RFS中位数为14.5个月，而水平降低患者为8个月（图2G）。这可能表明外周血淋巴细胞比例增加与治疗疗效之间存在潜在关联。
我们基于大规模真实世界中国黑色素瘤队列进一步探讨了中性粒细胞、淋巴细胞和NLR水平在切除的局部晚期黑色素瘤中的预后价值。回顾性纳入2016年1月至2024年1月在复旦大学上海肿瘤中心接受原发肿瘤和区域淋巴结转移完全手术切除的III期黑色素瘤患者。共384例切除的III期黑色素瘤患者被纳入（真实世界黑色素瘤队列1）。其基线和临床特征见表S2。
在单因素Kaplan-Meier曲线分析中，年龄、亚型、基因突变和溃疡与切除的III期黑色素瘤患者的MSS显著相关（图2H）。高术前中性粒细胞和低术前淋巴细胞水平与较差的MSS显著相关（图S1D和E）。X-Tile软件揭示了NLR的最佳预后截断值为1.6，该阈值能最佳地区分具有不同生存结局的患者亚组（图S1F）。高术前NLR表型（>1.6）患者与低NLR表型（≤1.6）患者相比显示出更短的MSS（图2H）。在多因素Cox回归分析中，最优NLR>1.6与切除的III期黑色素瘤患者较差的MSS独立相关（图2I）。此外，表现出高术前NLR的患者与低术前NLR患者相比显示出显著更短的RFS（图S1G），HR为1.708（95% CI=1.261-2.313）。
基于上述单细胞结果，本研究的辅助联合治疗降低了中性粒细胞比例并增加了T和NK淋巴细胞比例，这将有望将高NLR表型转化为低NLR表型。这些变化可能与黑色素瘤患者观察到的生存获益相关。
共获得29，426个T和NK细胞，详细注释鉴定出11种不同亚型，包括CD4+中央记忆T细胞（CD4Tcm）、CD4+记忆T细胞（CD4Tmem）、CD4+初始T细胞（CD4NaiveT）、CD8+效应T细胞（CD8Teff）、CD8+效应记忆T细胞（CD8Tem）、CD8+耗竭T细胞（CD8Tex）、CD8+黏膜相关不变T细胞（CD8MAIT）、CD8+初始T细胞（CD8NaiveT）、NK细胞、增殖T细胞（Proliferating T）和调节性T细胞（Treg）（图3A）。每种细胞类型的前3个标志基因展示于图3B。总体上，辅助联合治疗增加了CD8+ Teff、CD8+ Tem和NK细胞的比例（图3C）。联合辅助治疗后NK细胞的干扰素刺激基因（ISG）表达评分升高（图3D）。此外，联合辅助治疗增强了CD8+ Tem和NK细胞的细胞毒性（图3E）。
在联合辅助治疗前后对CD8+ Teff的差异表达基因进行了KEGG通路富集分析。辅助治疗上调了CD8+ Teff细胞中与自然杀伤细胞介导的细胞毒性相关的信号通路（图S2A）。类似地，辅助治疗上调了CD8+ Tem细胞中与核糖体、抗原加工与提呈以及自然杀伤细胞介导的细胞毒性相关的信号通路（图S2B）；辅助治疗上调了NK细胞中与细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NF-kappa B信号通路和内吞作用相关的信号通路（图S2C）。对T细胞亚群的差异表达基因进行了GSVA通路富集分析以探讨联合辅助治疗前后的功能改变（图S2D）。
伪时间分析表明CD8+ Tem和CD8+ Teff处于沿发育通路起源于CD8+ Naive T的终末分化阶段（图3F）。RNA速度分析表明CD8+ Tem分化为CD8+ Teff（图3G），从而发挥抗肿瘤免疫效应。涉及此分化过程的开关基因（图S2E）和转录因子（图S2F）被鉴定。
为探讨CD8+ Tem是否可作为切除的局部晚期黑色素瘤中辅助抗PD-1治疗疗效的生物标志物，我们纳入2023年4月至2024年11月在复旦大学上海肿瘤中心接受根治性切除的47例III期黑色素瘤患者（真实世界黑色素瘤队列2）。所有患者均有术前外周血CD8+ Tem水平测量并基于常规临床实践接受辅助抗PD-1治疗。CD8+ Tem水平（%）表示为CD8+ Tem细胞绝对计数相对于CD8+ T细胞总绝对计数的百分比。随访进行至2025年8月。基线特征见表S3。
关于CD8+ Tem队列的截断值原理，我们使用整个队列的中位值40.7%将患者二分为高和低两组。该方法确保两个亚组包含可比数量的病例（约各一半），提供平衡的样本量并优化检测差异的统计功效。基于中位值40.7%的截断，患者被分为CD8Tem_高（≥40.7）组（N=24）和CD8Tem_低（≤40.7）组（N=23）。通过未调整的Kaplan-Meier方法分析，高CD8Tem患者与低CD8Tem组相比展示了显著良好的1年RFS（87.1% vs 58.0%）和2年RFS（74.5% vs 32.6%）（图3H）。
联合辅助治疗增加了大型TCR克隆型的频率（图4A）。治疗后具有最高大型克隆型频率的患者P40（图4B）在临床上表现出超过21个月的最佳RFS（图2G）。这可能表明大型TCR克隆型频率的增加可能是联合辅助治疗疗效的另一个潜在机制。
在T细胞亚型方面，大型TCR克隆型频率的增加主要在CD8Tem和CD8Teff中观察到（图4C）。辅助治疗通过Chao1指数（图4D）和D50指数（图4E）测量增加了TCR克隆多样性。
治疗后T细胞亚型之间共享TCR克隆型的数量（图4F）相对于治疗前（图4G）升高。特别是，治疗后CD8Tem和CD8Teff之间共享TCR克隆型的数量（n=61）大于治疗前（n=54）。
辅助治疗增加了CD8Tem TCR α链的V基因TRAV12-2和TRAV20以及J基因TRAJ42的使用频率（图4H）。类似地，辅助治疗增加了CD8Tem TCR β链J基因TRBJ1-1的使用频率（图S3）。
7.联合辅助治疗对B细胞亚型和B细胞受体（BCR）组库的影响
B细胞被分为五个不同亚群，包括初始B、类别转换记忆B、未转换记忆B、浆细胞_1和浆细胞_2（图5A）。每种细胞类型的前3个标志基因展示于图5B。
辅助治疗未提升类别转换或未转换记忆B细胞的比例（图5C）。尽管如此，辅助治疗增强了初始B以及类别转换和未转换记忆B细胞的抗原提呈能力（图5D）。
伪时间分析揭示初始B细胞分化为类别转换/未转换记忆B细胞或分化为浆细胞_1和浆细胞_2（图5E）。联合辅助治疗通过Chao1指数、D50多样性、Hill数和逆Simpson指数测量增加了BCR克隆多样性（图5F）。
治疗后B细胞亚型之间共享BCR克隆型的数量（图5G）相对于治疗前（图5H）升高。特别是，治疗后初始B和未转换记忆B细胞之间共享BCR克隆型的数量（n=39）大于治疗前记录值（n=21）。治疗后初始B和类别转换记忆B细胞之间共享BCR克隆型的数量（n=28）也大于治疗前值（n=14）。
辅助治疗增加了BCR基因IGKV3-20、IGKV1-39（图5I）、IGKJ1（图5J）和IGHV4-59（图5K）的使用频率。
在MPs系统中鉴定出经典单核细胞（ClassicalMono）、非经典单核细胞（NonClassicalMono）和经典树突状细胞（cDCs）（图6A）。每种细胞类型的前3个标志基因展示于图6B。辅助治疗增加了非经典单核细胞的比例（图6C）。辅助治疗还增强了经典和非经典单核细胞的抗原提呈能力（图6D）。
非经典单核细胞对CD8+ Tem、CD8+ Teff和NK细胞的相互作用数量在治疗后较治疗前增加（图6E）。经典单核细胞对CD8+ Tem、CD8+ Teff和NK细胞的相互作用数量在治疗后也较治疗前增加（图6F）。cDCs对CD8+ Tem和NK细胞的相互作用数量在治疗后较治疗前增加（图6G）。
辅助治疗增强了CCL3、CCL4和CCL5配体与CD8+ Teff上CCR5受体之间的相互作用（图6H）。这一信号可促进Teff细胞迁移至炎症或肿瘤发展部位。辅助治疗增强了CXCL8配体（IL-8）与NK上CXCR2受体之间的相互作用（图6I）。CXCL8在NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。
更多结果和补充图表：doi：10.1186/s12943-026-02675-w
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