间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡（EV）作为无细胞疗法在多种疾病中展现出巨大潜力，但规模化生产的技术路线尚缺乏系统比较。本研究发表于《Trends in Biotechnology》，从4只幼年尤卡坦迷你猪的骨髓MSC出发，比较了三种不同细胞培养技术——传统2D培养板、微载体搅拌瓶和3D打印灌注生物反应器——对EV产量和内容物的影响。结果发现：微载体搅拌瓶的EV产量最高，蛋白和RNA含量也最高；蛋白质组学和miRNA测序分析表明，细胞培养方法对EV内容物的影响远大于供体差异。微载体来源的EV富集了促血管生成（EGF、VEGF）、抗凋亡（SOD、HSP90）和免疫调节（IL6ST、HGF激活因子）相关蛋白及miR-210、miR-27b-5p等促修复miRNA。体外功能实验证实，该类EV可促进内皮细胞管形成并改善缺氧诱导的心肌球收缩功能。本研究为EV疗法的规模化制造标准化提供了重要依据。
今天给大家解读一篇4月发表在《Trends in Biotechnology》上的题目为“Comparison of technologies for manufacturing extracellular vesicles for therapeutic applications.”的文章。本文从四头猪骨髓来源的MSCs中，采用三种不同细胞培养方法（标准组织培养板、3D打印灌注生物反应器、旋转烧瓶中的微载体）分离EVs，通过蛋白质组学和RNAseq分析其制造产量、特征及内容物，并利用体外管状形成和缺氧心脏球体收缩实验评估其治疗潜力。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《用于治疗应用的细胞外囊泡制造技术比较》Comparison of technologies for manufacturing extracellular vesicles for therapeutic applications
发表期刊：Trends in Biotechnology
影响因子：14.9
研究背景：
细胞外囊泡（EVs）因其作为治疗剂（基于旁分泌信号传导的天然机制）而受到广泛关注。然而，当前在EVs的分离和表征方法上存在显著异质性，需要开发新的方法来扩大EV的生产规模以满足治疗需求。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
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采用三种不同的细胞培养方法：标准组织培养板、3D打印灌注生物反应器、旋转烧瓶中的微载体。
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通过蛋白质组学和RNAseq分析EV制造产量、特征及内容物。
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进行体外管状形成和缺氧心脏球体收缩实验，评估EVs对血管生成和心脏细胞恢复的影响。
研究亮点：
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体外实验中，EVs分别改善了血管生成和心脏细胞恢复。
研究结果：
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体外管状形成实验中，EVs的存在改善了血管生成；缺氧心脏球体收缩实验表明EVs改善了心脏细胞恢复。
研究总结：
该研究表明，MSC供体与细胞培养方法共同影响EV产量，而EV分离方法则显著影响其蛋白质和RNA内容物的组成。作为迈向治疗应用的一步，EVs在体外显示出促进血管生成和心脏细胞恢复的潜力，为EV制造技术的优化和规模化生产提供了依据。
结果译文：
1.MSC-EV的粒径分布在生物供体和培养方法之间相似，而不同方法在EV生产可扩展性方面存在差异
本研究旨在建立一个可扩展的MSC-EV制造平台。使用从四只幼年尤卡坦迷你猪（雄性，平均年龄6.8±0.4个月，平均体重27.0±4 kg）分离的猪MSC，我们研究了两种动态细胞培养方法（微载体和灌注生物反应器），并将EV产量和内容物与在组织培养板上生产的EV进行了比较。我们观察到，灌注生物反应器和搅拌瓶系统均能维持大量细胞（接种时数量级为10⁸）。在所有培养平台上，MSC在整个培养期间均保持高活力，且微载体和灌注生物反应器系统中很少观察到细胞聚集（补充信息中的图S1和S2），这符合良好生产规范级细胞生产的要求，并且与其他人展示的结果相似。从所有MSC培养物的条件培养基中成功分离出MSC-EV，并保存在-80°C，在8周内使用，此前我们已证明在该时间范围内EV在心肌梗死模型中保留其治疗效果。
基于纳米颗粒追踪分析得到的四种不同生物供体（标记为供体1、2、3和4）和三种不同制备方法下的MSC-EV粒径分布如图2所示。尽管不同供体之间的粒径范围存在变异性，但中值和众数粒径仍保持在50-150 nm范围内，并且在供体或制备方法之间没有统计学显著差异（图2A、B）。根据CM体积归一化的产量，超速离心后，基于微载体的搅拌瓶方法和灌注生物反应器方法均比标准组织培养板提高了EV产量，效率高达六倍（图2C）。
我们的结果与先前的研究一致，这些研究表明动态生物反应器设置对EV收集具有高效率。例如，Watson及其同事报道，使用HEK293细胞在空心纤维生物反应器平台中，与静态条件相比，EV浓度增加了十倍。然而，这是永生化细胞系，作者报告了EV粒径分布的高度变异性。此外，de Almeida Fuzeta及其同事显示，在微载体上培养的骨髓来源MSC的EV产量增加了四倍。尽管他们的倍数差异低于本研究的发现，但他们的工作确立了在无异源条件下生产EV的可行性，进一步支持了EV用于治疗应用的GMP生产。本研究和其它研究中发现的EV产量增加，可能可以通过动态平台中增加的剪切力刺激了EV的产生来解释，其他研究团队已经探索了这个潜在机制。此外，跨培养平台的细胞增殖和产量的变化也可能解释了其EV产量的差异，因为动态条件通过增加表面积增加了培养中的细胞浓度。然而，需要进一步研究来确定动态条件增加EV产量的确切机制。
当考虑细胞培养装置的数目和支架需求时，基于微载体的搅拌瓶方法凸显为一种可扩展的系统。例如，产生10¹²个颗粒（估计大动物单次剂量）仅需要一个搅拌瓶中的488 ml条件培养基，而需要五个灌注生物反应器装置中的424 ml条件培养基或216个组织培养板中的3243 ml条件培养基才能产生相同的产量（补充信息中的表S1和S2）。尽管灌注生物反应器设置对培养基和细胞数量的需求较低，但从单个实验室规模的装置中获得全治疗剂量的能力，标志着微载体在搅拌瓶中对下游治疗应用具有显著优势。此外，灌注生物反应器系统中的污染问题更为普遍，进一步拉大了两种动态系统在易用性和便利性方面的差距。
在本工作中，我们在500 ml容器中建立了一个搅拌瓶生物反应器过程。然而，该过程可以扩展到高达20升的工作体积，并整合监测系统，实现受控的生产过程，并且可以进一步转化到高达10,000升的搅拌罐工业生物反应器。增加容器尺寸而无需重新定义细胞培养参数的能力，突显了基于微载体的搅拌瓶作为一个快速可扩展的EV制造平台的优势。为了证明微载体设置的最小批次间变异性，来自一个供体（供体4）的MSC在基于微载体的搅拌瓶系统中分别培养了三次（补充信息中的图S3）。尽管EV浓度存在一些变异性（±2e11颗粒/ml），但这些差异远低于文献报道的水平，并且中位粒径保持一致（±10 nm），验证了微载体方法作为一种可重复的制造大剂量MSC-EV的方法。
2.微载体搅拌瓶产生比其他培养方法更高的蛋白和RNA浓度
EV的RNA和蛋白质谱正在被新近探索，以了解EV的生物活性成分并表征EV的药效学。为了进一步表征来自不同生物供体和细胞培养方法的MSC-EV，我们通过microBCA和Qiazole提取实验分别量化了MSC-EV的蛋白和RNA浓度（图3）。微载体搅拌瓶方法产生了最高的蛋白和RNA浓度，进一步验证了该方法作为制造MSC-EV的最具可扩展性的方式。
3.蛋白质组学分析显示微载体搅拌瓶中促血管生成、抗凋亡和免疫调节蛋白上调
我们通过液相色谱-串联质谱成功对MSC-EV样品进行了蛋白质组学分析，使用Spectronaut进行肽段鉴定，使用Perseus进行统计分析，采用DirectDIA方法和Sus scrofa参考基因组。总共鉴定出5314个蛋白质组，其中1543个蛋白质在三种细胞培养方法之间存在显著差异。来自所有方法和供体的样品均含有四跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81，这些是广泛公认的小EV表面标志物，验证了小EV亚群的成功分离。
图4展示了按生物供体和细胞培养方法分的主成分分析。我们发现MSC-EV的蛋白质组学谱根据细胞培养方法而非供体紧密聚类，表明细胞培养方法比EV的细胞来源对蛋白质表达的决定性更重要。特别是，使用微载体培养的不同生物供体产生了高度相关的蛋白质组学谱。事实上，微载体方法在生物供体之间产生了最紧密的聚类，而灌注生物反应器产生了供体之间最大的变异，这突显了微载体作为可重复MSC-EV生产理想方法的另一个方面。补充信息中的图S4A展示了说明各组间相关性的Pearson相关分析。与PCA一致，微载体组内的相关系数很高（微载体组内每个供体之间>0.9），而每个供体内的相关系数较低。例如，对于供体1，供体1微载体与供体1灌注生物反应器之间的相关系数为0.63，而微载体内供体1与供体2之间的相关系数为0.91，表明细胞培养方法对蛋白质表达的驱动更为显著。
补充信息中的图S4B-D展示了使用微载体与灌注之间的成对比较进行的蛋白质组学数据层次聚类分析，包括火山图（图S4B）和热图（图S4C），以及显著性蛋白的富集分析（图S4D）。在分类蛋白中，与生物调节、代谢过程和刺激反应相关的蛋白似乎在MSC-EV内最为常见。补充信息中的图S4E-G展示了使用微载体与TCP之间的成对比较进行的蛋白质组学数据层次聚类分析，包括火山图（图S4E）和热图（图S4F），以及显著性蛋白的富集分析（图S4G）。与微载体和TCP之间的成对比较类似，与代谢过程、生物调节和定位相关的蛋白似乎最常富集。有趣的是，与灌注生物反应器和TCP相比，微载体方法导致了（i）促血管生成蛋白，包括EGF、STAT3、FGFR1、FGF7、vWF、Agrin和TIMP1-3；（ii）抗凋亡蛋白如SOD、HSP90和SDF1-3；以及（iii）免疫调节蛋白包括IL6信号转导蛋白和HGF激活因子的富集。此外，与灌注生物反应器来源的EV相比，基于微载体的EV具有显著更高水平的其他促血管生成蛋白，如VEGF和PDGFRbeta。
这些结果表明，细胞培养方法在生成EV的蛋白质表达中起着关键作用，并且为了在治疗应用中的可重复性，细胞培养参数需要保持恒定。这可能是由于培养方法的差异导致细胞微环境不同。一个潜在差异是剪切力，已有充分文献证明剪切力影响细胞中的蛋白质表达，我们推测它也可能改变其分泌EV中的蛋白质内容。基于本工作中使用的灌注生物反应器的先前计算模型，我们预计该系统中的平均剪切应力为1.5 mPa，最大应力为130 mPa，而针对我们研究的类似搅拌瓶的研究发现平均剪切应力为25 mPa，最大剪切应力为100 mPa。从这些结果我们可以推断，微载体中的细胞经历的应力范围比灌注生物反应器小，后者经历最大的应力变异，并且也是聚类最不紧密的培养组。类似地，在TCP上培养的细胞不经历剪切应力，该组的聚类也比灌注生物反应器好。然而，由于细胞系统是显著动态的，我们不期望剪切是影响蛋白质产生和分泌的唯一外部因素。需要进一步研究来探索蛋白质表达与供体变异和培养方法相关的机制差异。
本研究的局限性之一是EV样品中未分类蛋白的数量较多，这是由于与人类、小鼠和酵母等其他模式生物丰富的序列数据相比，猪参考蛋白质组中已鉴定的蛋白质较少。随着更多S. scrofa测序数据的可用，这种蛋白质组学分析将能够鉴定我们EV样品中发现的更多蛋白质。然而，据我们所知，这是首次对MSC-EV蛋白货物进行全面分析，以理解供体和细胞培养参数选择的重要性。
4.MSC-EV RNA测序分析显示微载体搅拌瓶中促血管生成、抗凋亡和免疫调节序列上调
文献中已在MSC-EV中发现了多种microRNA。虽然miRNA阵列常用于表征EV中发现的miRNA，但下一代测序提供了更广泛的可用miRNA，并允许通过无偏发现的组间比较。其他研究组的先前研究表明，由于低浓度输入和缺乏可重复性，标准RNAseq方法在EV样品上表现不佳。然而，小RNAseq最近已被研究并发现成功用于EV样品谱分析。使用基于Srinivasan及其同事的方法，他们通过不同的提取方案从不同生物体液中分离EV进行下一代测序，我们使用miRNAseq RNA提取方案成功从MSC-EV样品中分离出RNA，并使用NEB小RNA文库试剂盒进行互补DNA文库制备。使用BioAnalyzer 2100鉴定互补DNA文库的痕迹。
图5展示了按生物供体和细胞培养方法分的主成分分析。与我们的蛋白质组学分析类似，我们发现单个EV样品的miRNA谱根据细胞培养方法而非生物供体紧密聚类。有趣的是，与我们的蛋白质组学分析相比，我们在灌注生物反应器样品中观察到最紧密的聚类，而在微载体和TCP样品中观察到最大的变异。然而，这些结果证明细胞培养方法在收集的EV样品的miRNA含量中也起着不可或缺的作用。
补充信息中的图S5A、B使用灌注生物反应器与微载体样品的成对比较，通过火山图（图S5A）和热图（图S5B）展示了RNAseq数据的聚类分析。类似地，图S5C、D使用TCP与微载体样品的成对比较，通过火山图（图S5C）和热图（图S5D）展示了miRNA的层次聚类。每种培养方法的前十个表达miRNA显示在图S5E中。虽然灌注生物反应器样品聚类最紧密，但我们观察到该组与微载体和TCP样品之间的货物存在最大差异，再次说明当应用于治疗应用时需要一致且恒定的培养条件。
在报告的序列中，与细胞迁移和增殖、凋亡、血管生成和免疫调节相关的miRNA在所有三种方法中表达最高。其中，miR-21-5p在我们的数据中显示在所有三种细胞培养方法中每百万读段数最高，并且与细胞因子调节相关。miR-99和miR-148也被证明在免疫调节中很重要，并且在所有样品中高表达。与血管生成相关的miRNA，如miR-221、miR-27b和miR-10b，也在所有样品和所有培养方法中高表达。在微载体EV中，与生物反应器和TCP-EV相比，我们观察到miR-210、miR-221-5p和miR-27b-5p的表达上调。这些miRNA已被证明靶向促血管生成和抗凋亡机制。miR-210已在缺血性心脏病的小鼠模型中得到具体研究，并显示靶向Efan3和Ptp1b，导致血管生成上调和凋亡抑制。
这些结果以及对我们EV的蛋白质组学分析，说明了细胞培养方法对EV货物含量的影响，并证明了在收获EV时需要一致的培养条件。微载体EV聚类紧密，并显示出与其他培养方法相比参与血管生成和凋亡机制的特定miRNA上调。在所有样品中，我们还观察到与免疫调节及细胞迁移和增殖相关的miRNA上调。本研究的一个局限性是S. scrofa参考注释中可用的数据有限。与我们的蛋白质组学分析一样，随着更多数据的可用，我们将能够进一步表征EV样品中的miRNA表达。
5.MSC-EV在体外保护心脏免受缺氧损伤并支持血管生成
接下来，我们选择微载体方法和供体4用于体外实验，以评估这些EV的治疗潜力。虽然微载体与灌注生物反应器相比每毫升CM的产量相似，但能够在单个装置中（而非五个）获得全治疗剂量是微载体方法的一大优势，这有助于我们下游的可扩展性和临床前测试。此外，与其他设置相比，微载体来源的EV具有更高水平的治疗相关蛋白和RNA，也是促成这一决定的另一个因素。在体外测试之前，我们通过TEM成像评估了这些EV（补充信息中的图S6A），这通常用于确认EV形态和粒径分布。这些图像证实了我们EV的脂双层形态，其大小与我们的NTA结果非常一致（图2）。此外，我们通过ATR-FTIR评估了EV的纯度，发现蛋白与脂质的比率为1.8±0.2（图S6B、C）。这些值与文献中看到的值一致，包括来自使用SEC进一步纯化的EV的值。
接下来，我们使用心肌球收缩实验研究了供体4微载体MSC-EV的体外治疗潜力。具体而言，iPSC来源的心肌细胞被形成球体，并使用5 mM H₂O₂处理1小时来模拟心肌梗死，基于先前建立的方法。实验组在添加H₂O₂的同时加入MSC-EV。使用活细胞成像显微镜，我们评估了健康、H₂O₂损伤和损伤/MSC-EV处理的心肌球（代表性示例见补充信息中的视频S1）。与健康心肌球相比，损伤后心肌球的收缩幅度显著降低，峰-峰时间显著增加（图6A）。与单独损伤的心肌球相比，添加MSC-EV导致收缩幅度显著增加和峰-峰时间显著减少，表明MSC-EV改善了心肌损伤后心脏球的电激活。支持这些发现的是，Gao及其同事证明，来自人iPSC来源心肌细胞的EV通过增加Ca²⁺瞬变幅度、减少凋亡、提高ATP含量和上调缺氧诱导因子-1α来保护心肌细胞免受缺氧损伤。
接下来使用Matrigel管形成实验来评估供体4微载体MSC-EV的体外血管生成潜力，以生理盐水作为阴性对照。每面积节点、段和网格数的定量（图6B）显示，与对照组相比，用MSC-EV处理人脐静脉内皮细胞显著增加了血管结构的形成。这些结果与我们课题组先前的研究以及其他人的研究一致。
更多结果和补充图表：doi：10.1016/j.tibtech.2025.11.005
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