mRNA技术的临床成功（如COVID-19疫苗）依赖于UTR序列的优化设计，但现有5'UTR主要来源于少数常用基因（如HBA1），在衰老和肥胖等特殊人群中疗效有限。本研究通过整合人类和小鼠13种组织的RNA-seq、单细胞转录组、Ribo-seq及CLIP-seq公共数据，系统筛选出79个核糖体蛋白（RP）mRNA。发现RP mRNA的5'UTR普遍较短、丰度极高，且受LARP1和LARP4等翻译调控因子特异性结合。进一步筛选出RPS9、RPL18和RPL35的5'UTR，在HeLa、Nor10等多个人/鼠细胞系中，携带RPS9 UTR的合成mRNA的蛋白表达量比BNT162b2平台提高2.3-3.0倍。机制研究表明该增强不依赖TOP基序或二级结构，而与细胞内活性氧水平及LARP1/LARP4相关。在老龄小鼠（66周龄）和高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，RPS9 5'UTR使hEPO表达量提升9-12倍；在HPV mRNA疫苗中，RPS9 UTR显著增强抗原特异性IgG、IL-4和IFN-γ应答，恢复肥胖小鼠受损的体液免疫。本研究为mRNA疗法在老龄化及肥胖人群中的优化提供了新策略。
今天给大家解读一篇4月发表在《Molecular Therapy》上的题目为“Designing 5' UTR sequences improves the capacity of mRNA therapeutics in preclinical models of aging and obesity.”的文章。本文发现通过设计mRNA的5' UTR序列，特别是来源于核糖体蛋白RPS9的5' UTR，能够在衰老和肥胖小鼠模型中显著提升合成mRNA的蛋白表达及体液免疫应答，从而扩大mRNA治疗药物的应用潜力。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《设计5' UTR序列可提高mRNA治疗药物在衰老和肥胖的临床前模型中的疗效》Designing 5' UTR sequences improves the capacity of mRNA therapeutics in preclinical models of aging and obesity
发表期刊：Molecular Therapy
影响因子：12
研究背景：
mRNA作为治疗手段在COVID-19防控中得到广泛验证，但其非翻译区（UTRs）的序列设计决策尚缺乏探索，尤其在临床前模型中。本研究关注5' UTR，旨在发现能够改善衰老和肥胖小鼠模型治疗潜力的序列。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
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对RNA-seq、单细胞RNA-seq、核糖体分析及交联免疫沉淀后测序数据进行生物信息学分析，发现RP mRNAs丰富且普遍，但受LARP1和LARP4不同翻译调控。
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在11种RP mRNAs中筛选出RPL18、RPL35和RPS9的5' UTR，检验其对人类和小鼠细胞合成mRNA蛋白输出的影响。
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通过突变体5' UTR实验，探究其改善机制是否依赖末端寡嘧啶基序，并观察在不同活性氧水平细胞中的效果。
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在衰老小鼠和高脂饮食小鼠中，验证含RPS9 5' UTR的合成mRNA编码病毒抗原时的蛋白表达和体液免疫应答。
研究亮点：
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揭示了RP mRNAs通过LARP1和LARP4进行不同的翻译调控。
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发现RPL18、RPL35和RPS9的5' UTR可提高人源和鼠源细胞中合成mRNA的蛋白产量。
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证实该改善作用与末端寡嘧啶基序无关，但在活性氧水平高的细胞中表现显著。
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在衰老小鼠和高脂饮食小鼠中，含RPS9 5' UTR的合成mRNA增强了编码病毒抗原时的蛋白表达，并通过T辅助细胞2型细胞因子提高了体液免疫。
研究结果：
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RPL18、RPL35和RPS9的5' UTR可提高人源和鼠源细胞中合成mRNA的蛋白产量。
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突变体5' UTR表明该提升与末端寡嘧啶基序无关，但在活性氧水平高的细胞中效果显著。
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在衰老小鼠和接受高脂饮食的小鼠中，含RPS9 5' UTR的合成mRNA在编码病毒抗原时增强了蛋白表达，并通过T辅助细胞2型细胞因子提高了体液免疫。
研究总结：
本研究强调了UTR序列在扩大合成mRNA治疗潜力中的重要性，特别是对于老年人和肥胖患者。设计的5' UTR（如RPS9）能够改善mRNA在衰老和肥胖临床前模型中的疗效，为未来mRNA药物设计提供了新策略。
结果译文：
大多数（即使不是全部）用于动物实验和临床前研究的合成mRNA都基于在mRNA报告实验中常用的5'UTR序列。BNT162b2 COVID-19疫苗和BNT122新抗原疫苗使用的5'UTR序列主要来源于人HBA1/HBA2 mRNA。值得注意的是，该5'UTR序列也用于其他应用，包括mPDL1。mRNA-1273 SARS-CoV-2疫苗配备了最初为定向细胞分化开发的富含GC的5'UTR。我们针对HPV的mRNA疫苗临床前研究中使用的5'UTR序列来源于编码肌肉特异性基因人肌钙蛋白T1的mRNA。据我们所知，尚未开发出大规模数据驱动的计算框架来探索可能改善临床前模型中合成mRNA治疗效力的替代序列。
为了识别这些替代序列，我们利用大量可用的转录组数据来指导发现过程，旨在测试其在mRNA技术动物模型中的效力（图1A）。我们假设普遍存在且丰度高的mRNA的5'UTR可能是合成mRNA设计的合适候选者。它们不太可能含有诱导快速mRNA降解或触发不必要细胞内免疫反应的调控元件，反而促进跨各种细胞内外条件的普遍mRNA翻译。具体而言，我们利用了来自13种组织类型和14种人类细胞系的批量RNA-seq、scRNA-seq、CLIP-seq和Ribo-seq数据。数据分析与来自小鼠组织的批量RNA-seq和scRNA-seq数据并行进行，以确保效果可转化到基于小鼠的临床前模型中。例如，我们纳入了小鼠肝脏组织的批量和scRNA-seq数据。这是为了考虑到LNP配制的mRNA在IM和IV注射后通常被递送到小鼠肝脏并表达。CLIP-seq是一种揭示细胞内蛋白质-RNA相互作用的测序技术，在我们的计算框架中用于发现被翻译调控因子识别的人5'UTR。Ribo-seq涉及核糖体结合mRNA的全基因组信息，并提供其翻译潜力的分子见解。最后，我们整合了Gene Ontology Consortium定义的基因功能信息，因为具有共同功能的基因可能在它们的5'UTR中共享相似的调控元件。
我们调查了人类和小鼠13种组织类型（即脂肪、肾上腺、脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、乙状结肠、小肠、脾脏和睾丸）的批量RNA-seq数据。我们比较了不同功能组（即细胞组分、生物学过程和分子功能）的平均mRNA丰度（图1B）。展示了具有至少30个且最多150个人类蛋白编码基因的代表性非冗余GO术语。我们发现，与胞质核糖体（GO:0022626）、细胞质翻译（GO:0002181）和核糖体结构成分（GO:0003735）相关的mRNA相比其他GO术语的mRNA相对更丰富。这一趋势在人类和小鼠的各个组织类型中一致（图S1A），表明这些mRNA以不依赖于组织的方式持续丰富。我们发现，这三个核糖体相关GO术语的mRNA在人类和小鼠中分别含有中位长度为47-55 nt和104-131 nt的短5'UTR（图1C）。值得注意的是，它们的3'UTR也比其他GO术语的短（图S1B）。
核糖体蛋白mRNA构成了胞质核糖体（GO:0022626）、细胞质翻译（GO:0002181）和核糖体结构成分（GO:0003735）这三个GO术语的大部分。事实上，注释到至少2个这些GO术语的79个基因是核糖体蛋白。为了检查这些RP mRNA是否在单个细胞中高表达，我们重新分析了小鼠肝脏组织的scRNA-seq数据，并将其mRNA丰度与肝脏特异性基因进行了比较（图1D）。我们发现，在小鼠肝脏的不同细胞类型中，RP mRNA比肝脏特异性基因更丰富。在重新分析小鼠骨骼肌和脾脏组织的scRNA-seq数据时也发现了类似的趋势（图S1C和S1D）。这一结果表明，RP mRNA的UTR序列可能适用于不同给药途径的合成mRNA。
对三种人类细胞模型（HEK293、HeLa和U2OS）的Ribo-seq数据进行分析显示，与其他mRNA相比，RP mRNA更高度地结合核糖体（图1E）。值得注意的是，RP和其他mRNA之间的翻译效率相当（图S1E）。已知翻译调控因子（即LARP4、RPS3、DDX3X和IGF2BP1）在HepG2和K562细胞中的CLIP-seq数据在RP mRNA的5'UTR中显著富集，与其他mRNA相比（图1F）。特别是，LARP4 CLIP-seq数据揭示了在K562和HepG2细胞中RP mRNA分别有7.7倍和9.4倍的富集。在SPIDR数据中也发现了LARP1和LARP4的富集（图S1F），这是一种用于绘制RBP-RNA相互作用图谱的多重CLIP方法。LARP1识别并调控5'TOP mRNA的翻译，而LARP4已知通过结合poly(A)尾随后稳定mRNA来增强mRNA翻译。我们发现LARP4也与RP mRNA的5'UTR相互作用（图1F和S1F），表明LARP4也可能在调控RP mRNA翻译中具有靶向作用，其5'UTR可能适用于合成mRNA。
为了研究5'UTR设计对合成mRNA的影响，我们通过体外转录构建了编码荧光素酶报告基因的合成mRNA，并在HeLa细胞中测量其活性（图2A和S2A；表S1）。作为对照，我们使用了BNT162b2 mRNA平台，其5'UTR是人HBA1/HBA2 mRNA的衍生物，3'UTR是人AES mRNA和MTRNR1的衍生物。所有剩余的合成mRNA均使用我们之前用于HPV mRNA疫苗的mRNA平台生成。在那里，5'UTR来自人TNT1 mRNA，3'UTR是人RPS27 mRNA和人铁蛋白轻链mRNA的3'UTR的串联体。在我们鉴定的79个RP mRNA中，我们基于以下标准策略性地选择了11个RP mRNA的5'UTR：跨13种组织类型的平均mRNA丰度、TOP基序的存在和类型、其5'UTR长度及其最小自由能（表S3）。
在HeLa细胞中，我们发现我们12种合成mRNA的荧光素酶表达在转染后6小时均显著高于BNT mRNA（图2B）。5'UTR序列的选择导致荧光素酶表达有1.2至3.0倍的增加范围，表明5'UTR序列调节合成mRNA的早期翻译。注意，未发现合成RNA丰度的显著差异（图S2B），排除了在早期翻译中5'UTR依赖的mRNA丰度调节的可能性。在转染后24小时，发现了类似的趋势，其中8种合成mRNA的表达显著高于BNT mRNA和我们原始配备TNNT1 5'UTR的合成mRNA（图S2C）。特别是，配备RPS9、RPS10、RPL18和RPL35 5'UTR的合成mRNA导致荧光素酶表达有2.3倍或更高的改善，突显了5'UTR序列在晚期mRNA翻译和稳定性中的重要性。
为了检查序列扰动的影响，我们对RPS9、RPL35和RPL18的5'UTR进行了计算诱变，设计了碱基突变体、位置突变体和结构突变体（图2C）。RPS9、RPL35和RPL18的5'UTR含有一个TOP基序，这是生长依赖性翻译控制的顺式调控元件。对HepG2和K562细胞中LARP4 CLIP-seq数据的分析显示，在RPS9、RPL35和RPL18的5'UTR中存在CLIP峰（图S2D）。在HEK293T和K562细胞的LARP1 SPIDR数据中也发现了类似的峰（图S2E），表明这些RP mRNA的5'UTR可能受LARP1和LARP4调控。碱基突变体通过将TOP基序中的尿苷替换为胞嘧啶或腺嘌呤来设计。位置突变体改变了其TOP基序相对于其5'端的位置。结构突变体扰动TOP基序下游5'UTR的RNA结构，同时保留其原始核苷酸组成。值得注意的是，所有5'UTR突变体都具有完整的Kozak序列。总共，通过体外转录生成了24个配备5'UTR突变体的合成mRNA（图S3A-S3C）。
在转染后6小时，5'UTR碱基突变体显示出混合结果，即RPL35-A、RPS9-C和RPS9-A的荧光素酶表达相当（图2D）。在转染后24小时发现了类似的效果，RPS9-C和RPS9-A的表达相当（图S3D），表明TOP基序并非其蛋白质产量改善的原因。值得注意的是，RPS9-C mRNA的U到C替换可能并未完全消除其TOP基序的效应。相反，所有5'UTR位置突变体都导致荧光素酶表达下降，提示存在独立于TOP基序序列相对位置的合成mRNA调控的可能性。接下来，我们计算设计了RPS9（图2E和S3E）和RPL35（图S3F）5'UTR的结构突变体，其中我们增加或减少了二级结构中的碱基对数量。最大和最小结构突变体均导致合成mRNA的荧光素酶表达显著下降（图2E），排除了核糖体可及性直接结构干扰的可能性。这些结果表明在RPS9和RPL35 TOP基序下游存在一个反式调控元件，在HeLa细胞中具有功能。
为了测试这些反式调控因子是否为LARP1和LARP4，我们进行了多个小干扰RNA敲低实验，随后进行合成mRNA转染（图S2F）。具体而言，我们比较了配备TNNT1、RPS9和RPL18 5'UTR的合成mRNA的荧光素酶表达（图2F）。在转染后6小时，配备RPS9和RPL18 5'UTR的合成mRNA在LARP1耗竭后表现出荧光素酶表达的显著下降。这表明LARP1负责早期翻译的上调。在转染后24小时，我们发现LARP1耗竭后无显著变化，但LARP4耗竭后发现荧光素酶表达显著下降。这表明LARP1和LARP4均在合成mRNA翻译中起上调作用，很可能在不同阶段。
3.5'UTR设计在其他人和小鼠细胞模型中对合成mRNA的影响
为了检查这种效应是否在其他生物学背景下持续存在，我们将29种编码荧光素酶的mRNA转染到其他细胞模型中，即Nor10细胞、Hepa1-6细胞和HEK293A细胞中，并测量其活性（图3A）。具体来说，我们选择了可能代表mRNA技术发展不同方面的细胞模型。HEK293A是常用于腺病毒生产的人HEK293细胞的衍生物。大多数关于合成mRNA序列优化的研究都是在HEK293细胞衍生物中进行的。Hepa1-6是来自C57BL/6小鼠自发性肝癌的肝细胞癌细胞系。据报道，注射LNP包装的mRNA的小鼠在肝组织中表达，因此Hepa1-6可能是研究合成mRNA功能的合适细胞模型。Nor10是来源于骨骼肌的小鼠成纤维细胞。值得注意的是，近期报道显示通过IM注射给药的合成mRNA在肌肉成纤维细胞中表达。
在HEK293A中，我们发现配备RPS9、RPL18和RPL35 5'UTR的合成mRNA在转染后6小时和24小时均表现出显著高于BNT mRNA或带有TNNT1 5'UTR的荧光素酶活性（图3B和S4A）。相反，这种蛋白质产量的上调在Hepa1-6细胞中未发现，表明RPS9、RPL18和RPL35的5'UTR以细胞模型依赖的方式被调节。这与之前关于质粒编码转录本的5'UTR的报告一致，该报告显示在不同细胞模型（即HEK293T细胞、RD细胞、MCF-7细胞和C2C12细胞）中GFP表达存在差异。其他人提出合成mRNA中的5'UTR在细胞类型间的翻译相对不变，特别是在HEK293T、MCF7、K562、HepG2和A549细胞中。然而，他们用EEF1B2、NAE1、RICTOR和SRSF5 mRNA的5'UTR证明了这一点，而非RP mRNA。事实上，我们发现RPS9、RPL18、RPL35和其他RP mRNA在14种人类细胞系中丰富（图S5A），且比其他GO术语更丰富（图S5B），进一步支持了RP mRNA的5'UTR在不同细胞模型中可能经历替代调控途径的可能性。
出乎意料的是，在Nor10细胞中，配备RPS9、RPL18和RPL35 5'UTR的合成mRNA的荧光素酶活性比BNT mRNA显著增加2.5倍或更多（图3B和S4A）。这种蛋白质产量的倍数改善与我们在HeLa细胞中的结果相似（图2B）。维持活性氧是细胞中一个重要的调控模块，但已知癌细胞和肌肉细胞对细胞内ROS的含量具有更高的耐受性。为了研究这一点，我们通过流式细胞术和一般氧化应激指示剂CM-H2DCFDA测量了HeLa、Nor10、Hepa1-6和HEK293A细胞的基线ROS水平（图3C）。我们发现人HeLa细胞和小鼠Nor10细胞表现出显著高于Hepa1-6和293A细胞的基线ROS水平，表明RPS9、RPL18和RPL35的5'UTR的调节可能与细胞内ROS水平相关。在Nor10、Hepa1-6和HEK293A细胞中，带有5'UTR突变体的合成mRNA显示出荧光素酶表达下降，这让人想起我们在HeLa细胞中的结果（图3D和S4B）。在HeLa细胞中应用N-乙酰半胱氨酸抗氧化剂处理（图3E）显示，在ROS降低期间，带有RPS9和RPL18 5'UTR的合成mRNA的荧光素酶表达减弱，并在ROS恢复后恢复（图3F）。总之，这表明RPS9和RPL35 5'UTR内的反式元件以独立于其TOP基序和核糖体可及性的方式运作，但强烈依赖于细胞模型及其ROS水平。
4.5'UTR序列在小鼠寿命周期中对合成mRNA的影响
在人和小鼠细胞模型中测试了具有替代5'UTR的合成mRNA的改善效果后，我们随后想测试当我们的合成mRNA被LNP包装和递送时，这种效果是否能转化到动物模型中。我们特别关注了其在小鼠年龄和寿命跨度内的体内蛋白质产量（图4A）。基于我们在高ROS细胞模型中对改善合成mRNA的观察，我们假设带有RP mRNA 5'UTR的合成mRNA可能导致更高的蛋白质产量，因为衰老的生物学过程与较高的ROS水平有一定关联。先前关于小鼠寿命的研究报道，使用基于H2DCFDA的荧光探针测定，22-25个月龄的老年小鼠肝脏和血清中的ROS水平显著高于10-12周龄的年轻成年小鼠。同样，我们使用基于CM-H2DCFDA的荧光探针测定发现，51周龄小鼠血清中的ROS水平显著增加（图4B）。对年轻（8周龄）和老年（64周龄）小鼠scRNA-seq数据的分析显示，RP mRNA在单个肝细胞中高表达（图S6A）。在年轻和老年小鼠的脾脏组织中也发现了类似的结果（图S6B）。在RP mRNA中，RPS9、RPL18和RPL35的5'UTR是基于其比较的5'UTR长度、基因表达水平、核糖体结合、LARP1和LARP4的识别以及在高ROS条件下多个细胞模型中的效力而被考虑的。
具体来说，我们使用了带有TNNT1和RPS9 5'UTR的编码荧光素酶的mRNA（图S7A），并采用LNP封装，所得mRNA-LNPs直径为131-145nm，多分散指数为16.3%-21.6%（图4C）。我们通过IM注射将10 μg编码荧光素酶的mRNA-LNPs施用于6周龄和66周龄小鼠，以检查具有不同5'UTR的LNP包装mRNA的荧光素酶表达的生物分布（图4D）。如预期，6周龄小鼠的生物发光信号在肝脏和注射部位均有发现。在66周龄小鼠中，当注射配备RPS9 5'UTR的mRNA时，我们发现肝脏中的信号比配备TNNT1 5'UTR的更强。这一结果表明，RPS9的5'UTR改善了LNP包装mRNA在老年小鼠肝脏组织中的蛋白质产量。
由于LNP静脉注射已知能更好地将mRNA递送到肝脏组织，我们构建了编码人促红细胞生成素的mRNA，配备TNNT1、RPS9、RPL18和RPL35的5'UTR（图S7B），并配制了mRNA-LNPs（图S7C）。促红细胞生成素是一种血清分泌蛋白，已被用于测试合成mRNA在体内的治疗潜力。将编码hEPO的mRNA通过IV注射到9周、20周和44周龄小鼠中，通过ELISA测量血清中hEPO的表达量（图4E）。我们发现，注射带有TNNT1 5'UTR的mRNA的小鼠在寿命周期中hEPO表达无显著变化。在9周和20周龄小鼠中，具有不同5'UTR的mRNA的蛋白质表达相当。在44周龄小鼠中，配备RPS9和RPL18 5'UTR的LNP包装mRNA分别导致hEPO表达增加12.5倍和9.1倍。这一结果表明，RPS9和RPL18的5'UTR改善了合成mRNA在老年小鼠中的蛋白质产量，并突显了5'UTR在扩展合成mRNA治疗潜力中的重要性。
5.5'UTR序列在高脂饮食小鼠中对合成mRNA的影响
为了进一步测试这些5'UTR序列的治疗潜力，我们采用了肥胖临床前模型，即小鼠接受45%千卡的高脂饮食方案（图5A）。HFD方案是一种标准的诱导肥胖饮食，已知长期食用会导致糖尿病和其他代谢紊乱。在此HFD方案中，37周龄小鼠体重显著增加至40.5-52.6克（图5B），视觉上比年轻正常饮食小鼠更宽更圆（图S8A）。HFD 59周龄小鼠的空腹血糖浓度显著高于ND 15周龄小鼠（图S8B）。事实上，HFD小鼠血清中的ROS水平显著高于同龄ND小鼠（图5C）。对ND和HFD小鼠的scRNA-seq分析表明，RP mRNA在单个肝细胞和骨骼肌细胞中高表达（图S9A和S9B）。
为了研究我们的合成mRNA在HFD小鼠中的生物分布和蛋白质产量，我们首先将编码荧光素酶的mRNA-LNPs（图S8C和S8D）通过IM注射施用于36周龄HFD小鼠（图5D）。与ND小鼠不同，HFD小鼠仅在注射部位发现阳性生物发光信号。出乎意料的是，我们发现RPS9的5'UTR是唯一在HFD小鼠肝脏中导致强信号的序列，表明RPS9的5'UTR可能改善HFD小鼠肝脏中的治疗效力。接下来，我们配制了编码hEPO的mRNA-LNPs（图S8E和S8F），并将其IV注射到ND和HFD小鼠中。我们发现，与ND小鼠相比，HFD小鼠血清中带有TNNT1 5'UTR的hEPO表达显著降低了82%（图5E），表明其在HFD小鼠中的蛋白质产量相当有限。当用我们的其他5'UTR序列注射时，在ND小鼠中，带有RPS9 5'UTR的hEPO产量显著增加（图5F）。这种带有RPS9 5'UTR的改善在注射后3小时增强至2.7倍，6小时增强至4.5倍。总之，这证明了将RPS9的5'UTR整合到合成mRNA中的治疗潜力及其在其他基于mRNA的应用中的多功能性。
6.配备RPS9 5'UTR的抗原编码mRNA及其在HFD小鼠中的免疫应答
在多个细胞和小鼠模型中测试了具有不同5'UTR的合成mRNA的蛋白质产量后，我们想更进一步测试替代5'UTR序列是否可能导致抗原编码mRNA疫苗的免疫应答改善。我们特别关注将RPS9 5'UTR整合到我们先前开发的HPV mRNA疫苗中，及其在HFD小鼠中的效力（图6A）。回想一下，我们的HPV mRNA疫苗利用TNNT1 mRNA的5'UTR，并编码由人白蛋白信号肽和HPV 16和18型的E6/E7蛋白组成的融合蛋白。通过体外转录生成了带有TNNT1、RPS9和RPL35 5'UTR的抗原编码mRNA（图S10A）。与我们的细胞和动物工作一致，带有RPS9 5'UTR的抗原编码mRNA导致HeLa细胞中HPV E6抗原的产量提高（图6B），并在通过IM注射给药的小鼠肌肉组织中也如此（图6C和S10B）。
为了研究其体内免疫应答，我们对ND和HFD下的小鼠进行了IM注射。在14周龄ND小鼠中，与我们的原始HPV mRNA疫苗相比，带有RPS9 5'UTR的合成mRNA表现出HPV E6特异性免疫球蛋白G水平的适度增加（图6D）。然而，我们的原始HPV mRNA疫苗未能在63周龄HFD小鼠中引发抗原特异性免疫应答。这与先前关于HFD小鼠中SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性受损的报道一致。相比之下，配备RPS9 5'UTR的抗原编码mRNA确实导致了抗体滴度的显著增加，表明替代的5'UTR序列可能改善体内抗原呈递和随后的体液免疫应答，特别是在肥胖临床前模型中。
T细胞启动并不直接由mRNA疫苗的抗原表达水平决定，而是很大程度上取决于一个分步阈值，该阈值依赖于抗原呈递细胞（如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞）的数量。树突状细胞通过捕获、加工和向T细胞呈递抗原，在疫苗应答中发挥关键作用，从而增强适应性免疫应答。然而，有报道称，HFD小鼠树突状细胞中线粒体脂肪酸氧化的增加导致细胞内稳态和树突状细胞功能的改变。为了检查细胞免疫应答，我们首先量化了HFD小鼠脾脏中常规树突状细胞的数量（图6E和S10D）。与抗原特异性IgG水平一致，我们发现当注射我们的原始HPV mRNA疫苗时，HFD小鼠中cDC减少。带有RPS9 5'UTR的抗原编码mRNA在ND和HFD小鼠中均导致DC活化增加（图6E），表明mRNA疫苗的替代5'UTR序列可能改善HFD小鼠中的抗原呈递。值得一提的是，我们使用了相对高剂量的HPV mRNA疫苗，这可能已经超过了APC依赖性阈值，并在我们的体内模型中饱和了cDC1的交叉呈递能力。
当用HPV E6和E7肽刺激HFD小鼠的脾细胞时，带有RPS9 5'UTR的mRNA比带有TNNT1 5'UTR的mRNA诱导了更多的HPV抗原特异性IL-6（图6F）。IL-6在mRNA疫苗中通过促进T滤泡辅助细胞分化和支持IgG抗体产生发挥重要作用。通过ELISpot测量的IL-4和IFN-γ水平显示，带有RPS9 5'UTR的mRNA比带有TNNT1 5'UTR的mRNA导致更多的抗原特异性IL-4和IFN-γ释放细胞（图6G和6H）。IL-4是一种已知通过Tfh细胞和Th2应答驱动B细胞活化和IgG1抗体产生的细胞因子。已有报道称mRNA疫苗主要诱导Th1偏向的免疫应答，导致相对较弱的Th2相关体液应答。我们的结果表明带有RPS9 5'UTR的mRNA产生了更平衡的Th1/Th2应答。IFN-γ是一种Th1来源的细胞因子，促进细胞毒性T淋巴细胞的活化并增强细胞免疫。总之，这些发现证明了RPS9 5'UTR在为肥胖患者设计mRNA疫苗方面的潜力，以及替代5'UTR序列在基于mRNA的应用中的影响。
更多结果和补充图表：doi： 10.1016/j.ymthe.2025.12.060
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