乳腺癌是分子水平高度异质性的疾病，同一肿瘤内可共存不同分子亚型的癌细胞。然而现有分型方法多基于批量转录组，难以解析单细胞分辨率下的瘤内异质性。本研究开发了UBS93计算框架——基于93个癌细胞高特异性基因的分子分型工具。利用CCLE、TCGA等公共数据库及单细胞RNA测序数据，系统验证了UBS93在细胞系、患者组织和小鼠模型中的优异性能，尤其能精准识别高侵袭性Claudin-low亚型（F1=0.80）。应用UBS93分析人基底样乳腺癌单细胞数据，首次发现Basal-like和Claudin-low癌细胞群在单个肿瘤内共存——这种“混合表型”此前仅在小鼠模型中被报道。进一步分析提示Claudin-low细胞可能起源于Basal-like群体，转录因子ELF3下调可诱导部分Claudin-low表型。UBS93为解析乳腺癌瘤内异质性和进化机制提供了强大工具。
今天给大家解读一篇4月发表在《Communications Medicine》上的题目为“Intratumor heterogeneity in human basal like breast cancer is revealed by single cell molecular subtyping.”的文章。该研究针对乳腺癌分子亚型在肿瘤内共存（即肿瘤内异质性）的难题，开发了UBS93这一能够处理单细胞数据的分子分型工具。通过将其应用于人类基底样乳腺癌的单细胞RNA测序数据，首次在人类肿瘤中观察到基底样和Claudin-low癌细胞群体的共存，并进一步通过分析揭示了Claudin-low细胞源自基底样细胞，且ELF3的下调是这一转化过程的关键驱动因素。（请持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!）想薅生信资料羊毛？直接在对话框回复 “资料”，免费领取干货大礼包！包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献……0代码！鼠标点点点即可轻松完成5-10分生信SCI全文复现！
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题目：《人类基底样乳腺癌的肿瘤内异质性通过单细胞分子分型揭示》Intratumor heterogeneity in human basal like breast cancer is revealed by single cell molecular subtyping
发表期刊：Communications Medicine
影响因子：6.3
研究背景：
乳腺癌是一种分子异质性疾病，由多种内在亚型组成。近期研究强调了乳腺癌的显著肿瘤内异质性，即不同内在亚型的恶性细胞共存于同一肿瘤中。然而，大多数现有分型方法是为批量转录组数据设计的，因此无法在单细胞分辨率下解析这种异质性。这一局限性促使研究者开发能够适应单细胞数据特性的新分型策略。
CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼全文要点
研究思路：
- 开发工具
构建名为UBS93的计算框架，使其既能处理批量肿瘤样本，也能对单个乳腺癌细胞进行稳健的分子分型。
- 验证性能
严格验证UBS93，并证明其相对于现有方法具有更优性能，尤其擅长识别高度侵袭性的Claudin-low亚型。
- 应用分析
将UBS93应用于人类基底样乳腺癌的单细胞RNA测序数据，检测肿瘤内是否存在不同亚型共存的异质性。
- 机制探究
通过进一步分析，追踪Claudin-low癌细胞的起源，并探索调控亚型转换的关键分子（如ELF3）的作用。
研究亮点：
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首次在人类基底样乳腺癌中通过单细胞分辨率证实了基底样与Claudin-low亚型癌细胞的共存，此前该现象仅在小鼠模型中有报道。
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明确了Claudin-low癌细胞起源于基底样群体，并鉴定了转录因子ELF3在亚型转换中的核心调控作用。
研究结果：
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应用UBS93后，在同一人类基底样乳腺癌肿瘤内发现了基底样和Claudin-low癌细胞群体的共存——这是一种此前仅在具有基因工程改造RAS通路改变的小鼠模型中观察到的肿瘤内异质性形式。
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进一步分析表明，Claudin-low癌细胞起源于基底样群体，转录因子ELF3的下调在基底样/Claudin-low转换过程中起关键作用。
研究总结：
本研究确立了UBS93作为乳腺癌分型强大工具的地位，并成功揭示了人类基底样乳腺癌内部的肿瘤内异质性。这一发现不仅验证了单细胞分型方法的可行性，还提示ELF3可能成为干预基底样乳腺癌亚型转换的潜在靶点。同时，研究也强调了在单细胞水平解析肿瘤内异质性对于理解乳腺癌进展和耐药机制的重要性。
结果译文：
实体瘤组织是由多种细胞类型组成的异质性混合物。在批量RNA测序中，一个基因的测量表达反映了其在所有组成细胞中表达的加权平均值。具体而言，对于给定基因g，如果其在癌细胞和非癌细胞中的平均表达分别记为C_g和M_g，肿瘤纯度为α，那么批量样本中的观测表达可近似为α*C_g + (1-α)*M_g。因此，由于肿瘤微环境的影响，批量肿瘤样本中的基因表达排名可能与纯癌细胞中的排名存在显著偏差（图1a，左图）；然而，对于癌细胞高度特异的基因（即M_g≈0），批量肿瘤样本和纯癌细胞中的排名预计会保持高度一致（图1a，右图）。这一观察结果表明，癌细胞特异性基因的相对表达排名可作为分子分型的稳健特征。
为了鉴定此类基因，我们分析了Wu等人研究中的单细胞RNA测序数据集，并计算了每个基因的“C-M比值”，以表示其在癌细胞中的表达特异性。在C-M比值最高的前100个基因中，有7个缺少ENSEMBL ID而被排除。其余93个基因形成了一个统一的乳腺癌分子分型基因组，称为UBS93（补充数据1）。正如预期，UBS93基因在癌细胞中的表达显著高于非癌细胞（图1b）。
为了验证该基因集，我们利用癌症细胞系百科全书中的乳腺癌细胞系数据，该数据库将细胞系分为五种亚型：basal_A、basal_B、luminal、HER2扩增型和luminal-HER2扩增型。对CCLE批量RNA-seq数据的t-分布随机邻域嵌入分析显示，聚类模式与这些亚型一致（图1c），支持了CCLE分类的有效性。为了与广泛使用的乳腺癌命名法保持一致，我们将basal_A和basal_B分别重命名为Basal-like和Claudin-low，并将luminal-HER2扩增型亚型排除在进一步分析之外，得到四个精炼的亚型：Basal-like、Claudin-low、Luminal和HER2-amp。随后，我们仅使用UBS93基因集对同一CCLE数据集进行了t-SNE分析（补充图4）。得到的亚型特异性聚类与全转录组分析结果一致，证实了UBS93在区分乳腺癌亚型方面的实用性。
基于这些观察，我们开发了UBS93亚型分类器（图1d）。首先，我们创建了一个93×4的亚型质心矩阵，其中每一列分别代表Basal-like、Claudin-low、Luminal或HER2-amp对应的CCLE细胞系中UBS93基因的平均表达谱。对于给定的批量RNA-seq或scRNA-seq基因表达谱，我们计算其与每个亚型质心的Spearman秩相关系数，并将其分配到相关系数最高的亚型。如果样本被分型为Luminal或HER2-amp，我们进一步根据HER2-amp特征基因计算富集分数，以确定最终亚型归属。
我们首先使用一个包含从GEO数据库提取的47个乳腺癌细胞系批量RNA-seq谱的组装数据集评估了UBS93分类器的性能（补充数据2）。我们发现93.6%的样本分布在混淆矩阵的对角线上，表明我们的方法具有较高的总体准确性（图2a）。值得注意的是，我们的分类器还表现出最佳的亚型特异性性能，四种亚型的F1分数分别为0.97（Basal-like）、0.80（Claudin-low）、1.00（HER2-amp）和0.92（Luminal）。除细胞系外，我们还在癌症基因组图谱的乳腺癌样本上评估了分类器，获得了理想的总体准确性（81.9%）和亚型特异性性能（Basal-like:0.78；Claudin-low:0.67；Her2-amp:0.51；Luminal:0.89）（图2b）。
接下来，我们使用一个人乳腺癌细胞系的组装scRNA-seq数据集验证了分类器（补充数据3）。对于每个细胞系，我们计算了被正确分型的细胞比例作为准确性。我们的分类器在30个细胞系中的19个（63.3%）达到了高于80%的准确性，中位准确性为85.7%。亚型特异性中位准确性分别为：Basal-like为99.0%，Claudin-low为98.3%，HER2-amp为78.0%，Luminal为75.7%（图2c）。
我们还在一个包含27个小鼠来源研究的批量RNA-seq样本的数据集上验证了分类器。该数据集包括来自Holler研究的17个样本（实验证实为Claudin-low）和来自Rädler研究的10个样本（亚型标签未知）。基于五个“Claudin-low指示性”基因（Cldn3、Cldn13、Cldn7、Vim和Epcam）的层次聚类，我们推断了缺失的亚型标签（图2d）。UBS93分类器将所有27个样本准确分配了亚型，结果与已知亚型一致（补充数据4）。
我们将UBS93分类器与genefu（一个广泛使用的乳腺癌分子分型R包）进行了系统比较。值得注意的是，UBS93和PAM50基因组之间仅有六个基因重叠（补充图5a）；此外，与PAM50基因相比，UBS93基因表现出显著更高的C-M-比值和癌细胞特异性（补充图5b）。在使用TCGA乳腺癌样本的批量RNA-seq数据比较分类器性能时，genefu实现了稍高的总体准确性（83.7%）。然而，UBS93在分类Basal-like、Claudin-low和HER2-amp亚型方面优于genefu（图3a）。在小鼠数据集中，genefu将所有Basal-like样本错误分类为Claudin-low，而UBS93将它们准确识别为Basal-like（补充数据5）。
除了genefu，我们还使用与评估分类器相同的scRNA-seq数据集，将UBS93与SCSubtype（一种专为单个乳腺癌细胞分型设计的方法）进行了比较。由于SCSubtype不包含Claudin-low亚型，比较集中在其他三个亚型上。对于Basal-like亚型，UBS93显示出比SCSubtype显著更高的准确性（图3b）。
在我们研究之前，Wu等人已在人ER+乳腺肿瘤中鉴定出Basal-like癌细胞，揭示了ER+乳腺癌中瘤内异质性的存在。然而，三阴性乳腺癌的瘤内异质性仍未得到充分探索。为了研究这一点，我们重新检查了从12个已建立的Basal-like乳腺癌细胞系的scRNA-seq数据集中得出的UBS93分型结果。在其中10个细胞系中，超过80%的单细胞被分类为Basal-like，这与批量RNA-seq数据得出的分型结果一致。引人注目的是，在典型的Basal-like细胞系HDQP1中，只有56.4%的细胞被分类为Basal-like，而其余细胞被分型为Claudin-low（图2c）。这些发现使我们假设，尽管基于批量转录组谱被分类为Basal-like，HDQP1实际上由Basal-like和Claudin-low癌细胞群的混合物组成。
为了验证这一假设，我们对HDQP1 scRNA-seq数据进行了t-SNE可视化，并观察到两个不同的聚类（图4a）。UBS93分析显示，聚类1完全由Basal-like细胞组成，而聚类2中84.2%的细胞被分型为Claudin-low。差异基因表达分析（Claudin-low vs Basal-like）表明，鉴定出的Claudin-low细胞表现出Claudin-low乳腺癌的典型特征。这些包括：（1）细胞粘附基因（如CLDN4、CLDN7、KRT19和EPCAM）表达降低（图4b，补充图6，补充数据6）；（2）上皮-间充质转化水平升高，表现为VIM上调以及上调的DE基因中EMT特征基因富集（图4c）；以及（3）干性增强，表现为CD44（癌症干细胞标志物）表达增加和CD44/CD24比值升高（图4d）。
为进一步验证这些发现，我们使用被分型为Claudin-low的HDQP1细胞生成了伪批量转录组谱，并计算其与CCLE项目中乳腺癌细胞系的转录组相关性。CAL120——一个公认的Claudin-low细胞系——表现出最高的相关性，前五个最相关的细胞系中有四个是Claudin-low（图4e）。相反，使用被分型为Basal-like的HDQP1细胞进行的类似分析显示，HDQP1本身是相关性最高的细胞系，前五个相关细胞系全部是Basal-like（图4f）。为了再次确认我们的发现，我们在一个独立的HDQP1 scRNA-seq数据（GSE202771）上重复了分析，并得出了相同的结论（补充图7、8和补充数据7）。因此，我们的计算分析表明，Basal-like细胞系HDQP1是Basal-like和Claudin-low细胞群的混合物。
据我们所知，这种“Basal-like/Claudin-low混合”表型此前仅在RAS信号通路基因调控后的小鼠模型中被报道，在人Basal-like乳腺癌细胞系HDQP1中尚无先例。为了在患者中以单细胞分辨率进一步研究这种表型，我们接下来将UBS93分类器应用于50个TNBC样本的scRNA-seq数据。然后根据Claudin-low细胞与UBS93 Claudin-low质心的中位转录组相关性对这些样本进行排序（图4g，补充数据8）。正如预期，来自数据集GSE176078的化生性乳腺癌患者CID4513排名最高，这并不意外，因为先前研究已证实化生性乳腺癌表现出Claudin-low亚型的特征。有趣的是，来自数据集GSE161529的患者0554（文献中分类为Basal-like）排名第二。在该患者的癌细胞中，91.1%被分型为Basal-like，而7.9%为Claudin-low。与HDQP1类似，Claudin-low细胞在t-SNE图上倾向于形成不同的聚类（图5a），同时在DE分析（Claudin-low vs Basal-like）中表现出Claudin-low乳腺癌的典型特征：粘附基因下调、EMT特征富集以及干性标志物升高（图5b、5c、5d、补充图9和补充数据9）。此外，我们还进行了伪批量样本与CCLE乳腺癌细胞系之间的转录组相关性分析，双重确认了我们的结果（图5e、5f）。
总之，我们的综合分析揭示了人基底样乳腺癌中的瘤内异质性，其特征是Basal-like和Claudin-low癌细胞在同一肿瘤内共存。这些发现凸显了UBS93检测乳腺癌中细微但具有生物学意义的亚结构的强大能力，并强调了其在研究肿瘤进化和可塑性方面的潜在应用价值。
5.ELF3敲低在基底样乳腺癌中诱导部分Claudin-low表型
为了研究所观察到的异质性的根本原因，我们首先检查了Claudin-low癌细胞的细胞起源。Pommier等人对批量癌症基因组学数据进行了大规模计算分析，提出了三种潜在的起源：从正常乳腺干细胞直接恶性转化，或从Luminal或Basal-like癌细胞转分化。然而，来自患者样本的稳健单细胞水平证据一直缺乏。我们研究中Basal-like/Claudin-low混合物的鉴定为重新审视这个问题提供了独特的机会。在患者0554中使用基于拷贝数变异的层次聚类，我们观察到Claudin-low癌细胞与Basal-like癌细胞关系最密切（图6a），支持了Claudin-low癌细胞可能起源于Basal-like谱系的假设。
为了识别可能驱动Basal-like/Claudin-low转换的基因，我们取HDQP1细胞系和患者0554的DE基因列表的交集，揭示了18个共同上调和37个共同下调的基因（补充数据10）。其中，转录因子ELF3因两个原因而成为感兴趣的基因（补充图10）。首先，在Claudin-low癌细胞系中过表达ELF3会抑制EMT过程；其次，ELF3在卵巢癌和非小细胞肺癌中促进CLDN4表达。这些发现促使我们测试在Basal-like癌细胞中耗竭ELF3是否可能诱导Claudin-low表型。
我们选择HCC70作为实验模型，其转录组谱与Basal-like乳腺癌非常相似。通过scRNA-seq和UBS93分型确认，98.7%的未处理HCC70细胞被分类为Basal-like。然后我们在HCC70中进行ELF3敲低，并重复scRNA-seq以确定这种扰动是否能促进Claudin-low特征。UBS93分析显示，98.1%的细胞仍为Basal-like，提示单独ELF3敲低不足以触发完全亚型转换（补充图11a）。
尽管未能诱导完全的Basal-like/Claudin-low转换，我们询问ELF3敲低是否能诱导部分Claudin-low特征。为考虑可变敲低效率，我们选择了ELF3表达最低的100个细胞（sh-ELF3组）和ELF3表达最高的100个细胞（对照组）进行进一步分析（补充图11b）。有趣的是，sh-ELF3组与Basal-like质心的相关性显著降低，与Claudin-low质心的相关性显著升高（补充图11c、11d），并且这两组之间的DE分析揭示了基因表达的变化（图6b）。正如预期，CLDN4显著下调（p值=3.57e-14），上皮细胞标志物KRT19也下调（p值=3.59e-13）。我们基于CCLE乳腺癌细胞系中的表达模式对79个下调基因进行了层次聚类分析，得到三个聚类。有趣的是，我们发现聚类1中的基因表现出Claudin-low特异性耗竭（图6c）。我们整理了一组这样的基因（称为CLSD基因），基因集富集分析显示，在下调的DE基因中，CLSD基因显著富集（补充图11e）。
除了scRNA-seq，我们还使用qRT-PCR评估了ELF3敲低如何影响CLDN3、CLDN4、CLDN7、EPCAM和VIM的表达（图6d）。与scRNA-seq结果一致，ELF3敲低后CLDN4显著下调（p值=0.002254），CLDN7也显示出表达降低，尽管未达到DE基因阈值（p值=0.018557）。在CLDN3和EPCAM中未观察到显著变化。出乎意料的是，VIM表达下调（p值=0.003883），这与ELF3作为EMT抑制因子的报道角色相矛盾，值得进一步研究。重复实验双重确认了这些发现（补充图12）。
总之，这些结果表明，ELF3敲低在Basal-like癌细胞中诱导了部分Claudin-low表型，表现为CLSD基因（如CLDN4和CLDN7）的下调。
更多结果和补充图表：doi： 10.1038/s43856-026-01548-z
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