[Method]活细胞成像方法介绍

活细胞成像技术彻底革新了生物学家研究细胞、蛋白质以及众多分子之间相互作用和生理过程的方式。这项技术使得科学家们可以实时或者在一段时间内观察细胞内部结构和细胞生理过程。了解这些细胞结构和动态过程对于解释许多细胞生物学问题是至关重要的。与固定细胞的成像研究中提供的“快照”相比，对于动态变化的观察使得人们对细胞的运作过程的认识更加深入。此外，由于活细胞成像更不容易引入实验伪影，它通常能提供比固定细胞成像更加真实可靠的信息。这篇综述将回顾活细胞成像的系统构成、使用的探针、常见的方法和应用。

活细胞成像的应用

使用活细胞成像方法可以回答一系列广泛的的生物学问题。最热门的应用包括细胞结构组分的检测，动态过程的研究以及分子的细胞定位。细胞完整性、胞吞、胞吐、蛋白质转运、信号转导和酶活性等过程都可以被检测。此外，一些特定的成像系统也可以用来观测活体动物中的分子。

维持细胞健康

在活细胞成像实验中的首要大事是在细胞内维持一个正常的代谢状态。在没有培养基或者适宜温度的条件下，细胞只能维持几分钟的正常活动。对于短期成像来说，维持细胞的健康就显得不那么重要了，但是对于长达几个小时或者几天的成像来说，就急需去注意那些能引起代谢功能改变的因素。细胞外环境的变量包括：pH值、湿度、氧气、气压、温度和渗透压。

细胞培养基的pH值通常由HEPES缓冲液来控制，这样一来就不需要5%的CO2来维持。湿度可以通过使用密封的培养皿或者加湿的环境来维持在98%附近。对于长期实验来说，氧气可以通过经常性的更换培养基或者在初期给与过量的培养基来维持。渗透压一般维持在300mosM左右，这可以通过密封的培养皿来防止蒸发或者加湿环境来实现。在活细胞成像实验中常用的气体条件为空气或者5%的二氧化碳。对于开放的，或者密封的以及空气可控的培养皿，一般还要使用HEPES缓冲的培养基来维持气压的稳定。维持细胞在最适温度是非常关键的，因为即使是几度的波动都会扰乱细胞生理机能。温度通常由显微镜载物台加热器或者（和）物镜加热器来调控。另外一种常见的维持温度的方式是使用整合在细胞培养皿之内的加热元件。但是，显微镜物镜作为一个散热器会抵消加热台的效果。物镜加热器可以是金属箔毯、铜管水套或者闭环加热器。为了维持温度，在培养皿内加入足量的培养基充当热质，也可以减少温度的波动。将显微镜整体装入一个箱子中并加热其中的空气是一种更加全面的加热方式。这种方式防止了温度梯度，并使得显微镜的各个部分都保持在同样的温度，但是这样一来却限制了研究者对显微镜的使用。

表一：在长期或者短期的活细胞成像实验中维持细胞健康的常见方案。

荧光标签

荧光探针背景介绍

分子荧光探针极大地提升了人们探索细胞结构和细胞过程的能力。它是指能够吸收某个特定波长的光并发射出更长波长的光（荧光）的化学基团。活细胞成像技术正是利用这些荧光探针，比如小分子有机染料或者量子点来特异性的标记感兴趣的分子。能与蛋白质天然或者人工连接的荧光探针都会在荧光成像中用到。荧光基团发展的趋势在于增加其亮度，减少细胞毒性并使得细胞成像获得高信噪比。使用荧光探针的另外一个要点是要确保它们在进入细胞时不会对细胞造成损伤。探针进入细胞的方法包括：将染料脂化以促进细胞对其吸收，使用合成囊泡来包裹探针，以及使用机械的方法，例如显微注射和电穿孔。

天然发光的绿光荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）最早是从水母中分离得到的，它的发现对细胞成像来说是革命性的。作为对这项工作的认可，下村修（Osamu Shimomura）、马丁·查尔菲（Martin Chalfie）和钱永健（Roger Tsien）在2008年因发现和改进了GFP被授予了诺贝尔化学奖。此后，人们开发了许多其它天然发光和人工改造的荧光蛋白（luorescent proteins，FPs）。荧光蛋白或者能自发荧光，或者选择性标记有一个荧光标签。荧光蛋白分子一般比较大，对于一些研究来说并不合适。这时，大小小于1kDa的小分子有机染料，例如荧光素和若丹明，或者大小小于10nm的，被称为量子点的无机纳米晶颗粒，就成为一种替代方案。与荧光蛋白相比，这类小分子荧光探针对于兴趣分子自然行为的影响更小。

荧光蛋白

具有荧光标签的蛋白质在各类活细胞成像实验中应用广泛。这类蛋白质具备有机染料和量子点不具备的优势。比如，它们具有靶向定位亚细胞结构的能力，并且细胞毒性非常低。GFP是这类荧光探针中第一个被发现的成员。它已经被广泛应用于细胞成像和其他许多细胞和分子生物研究。GFP的荧光基团是由3个相邻的氨基酸：丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸组成的。这个基团被氧激活后可发出荧光。GFP应用广泛原因在于它的基因能在不损伤细胞的前提下，在哺乳动物细胞中表达并产生一个可以发出荧光的功能蛋白。一些能增加表达量或者减少其温度敏感性的GFP衍生物在组织培养活细胞和活体成像实验中应用非常广泛。将GFP的基因序列突变后可以得到蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP）。这两种蛋白的激发和发射性质和野生型的GFP相比有一些改变。黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白衍生物的发射特性更不相同，这使得研究者可以在同一个细胞同时通用几种荧光蛋白探针。荧光蛋白的缺点在与他们的尺寸比较大（27Kd），以及其β桶装结构。后者是其发光所必须的。为了解决这些弊端，并发挥其能与细胞特异性结合，低毒性的特点，人们开发了荧光多肽。这种荧光标签的的尺寸更小，对目标天然行为的改变更少。最后，虽然GFP及其衍生物对于活细胞成像是非常有价值的工具，但是通常对于待研究的细胞来说它们都是外源蛋白。许多不发荧光的天然蛋白质可以通过共价、非共价或者酶方法来标记荧光染料。

有机荧光探针

最传统的荧光探针有：荧光素、若丹明、吖啶橙、碘化丙啶（PI）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料。这些染料大多由紫外光或者蓝光激发。异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）是一种基于氧杂蒽的荧光染料。由于其高信噪比，它在宽场和共聚焦荧光显微镜中都广泛应用。但是，荧光素的激发强度对于pH的变化是非常敏感的，并且其激发光谱比较宽，会与其他荧光探针的激发光谱重叠。这就使得双重或者三重染料标记显得比较困难。若丹明是另外一种小分子有机探针，随着吸收和发射的微小改变其名字也有许多变种。与荧光素相比，若丹明衍生物对于外部环境的依赖更小，因此也更适于多重标记实验。吖啶橙是一种能插入DNA碱基对，或者与RNA和单链DNA结合的染料。它能在细胞膜上自由扩散，在溶酶体中积累。碘化丙啶也能与DNA结合，而且还与双链RNA有亲和力，通常用于双重或三重标记试验中对细胞核的染色。DAPI和Hoechst染料能与DNA双螺旋特异性的结合，同样也是一种非常常用的多重标记实验中的细胞核染色剂。

花青染料的荧光特性和传统的荧光素染料类似，但是它们的光稳定性和水溶更强。这个家族包括Cy2, Cy3, Cy5, Cy7以及它们的衍生物。这些染料的活性染料形式或者和其它分子的偶联物都可以商业获取。Cy5衍生物能被红光区域的光（650nm）激发，因此它们的发射就在远红区域（680nm）。由于大多数传统染料的激发光为紫外，发射为蓝光，因此，Cy5染料在三重标记实验中应用广泛。但是，正因为Cy5的激发在远红光区域，其发射光也只能由特殊的CCD相机来检测。

活细胞成像中也经常用到能够与无机离子，金属离子，硫醇，硫化物相互作用的荧光探针。这类探针被称为光敏感指示剂。与特定的目标离子结合后它们荧光特性会发生改变。许多指示剂，例如fura-2 和indo-1能与钙离子相互作用，它们可以用于测量细胞内的局部钙离子浓度，也可以用于定量检测质膜上的钙流的改变。使用特定的指示剂也可以测量其他一些金属离子，如镁离子，钠离子，钾离子，锌离子等。细胞器本身也也可以用特异的荧光标签选择性的特异标记。常见的细胞器探针有MitoTracker和MitoFluor。LysoTracker和LysoSensor探针常用来标记溶酶体，BODIPY及其衍生物常用来标记高尔基体。

显微镜

光学显微镜

显微镜是活细胞成像系统的心脏。显微成像系统既需要显微镜也需要把图像记录下来，这一般是由CCD相机来实现的。标准的光学显微镜，也被成为明视场显微镜，是利用可见光来进行成像的。尽管明视场显微镜在一些基础细胞生物学领域得到了很好的应用，但由于其相对低的对比度和分辨率，它的应用也受到了限制。既然细胞内的结构是没有颜色的，那么使用染料对细胞进行着色便能改善明视场显微镜成像的质量，但是这样做需要将样品杀死或者固定。染色也可能会引入造成样品自然状态改变的假象。暗视野显微镜能够增加未染色样品的对比度。其原理是：降低到达成像平面的非散射光，并只收集经由细胞散射的光。但是暗视野显微镜的分辨能力仍然相当低。相差显微镜比明视场或暗视场显微镜具有更好的对比度，因为它降低了直射光的强度，并创建一个四分之一波长的相位差。这使得直射光的特性发生了改变，并与衍射光发生干涉，由此产生相差图像。遗憾的是，相差显微镜只适用于较薄的样品。而在较厚的样品上会产生光晕并导致图像细节变得模糊。微分干涉相差显微镜（Differential interference contrast microscopy，DIC）比相差显微镜具有更好的分辨率。它被用于包括细胞迁移研究（伤口愈合）在内的活细胞成像试验中。微分干涉相差显微镜需要一个偏振光源，两个偏振片，以及一个特殊的分光棱镜。这个分光棱镜能将光分成两束。这两束光在细胞折射表面（如细胞核）产生的差异会在图像上产生浮雕样的效果。

常规荧光显微镜

荧光显微镜在活细胞成像中应用非常广泛，它是指各种形式的使用荧光染料对分子进行着色的显微成像技术。由于能够突出细胞环境内的感兴趣的特异结构，这项技术对细胞生物学领域，特别是活细胞成像领域极其重要。用来激发荧光染料的激发波长和发射波长是不相同的。因此，通过采集发射光我们就可以得到荧光染料所标记的特异分子或结构的图像。旨在阻止激发光到达检测器的滤光片非常重要。和明视场显微镜、暗场显微镜以及相差显微镜相比，荧光显微镜优势在于可以同时使用不同的荧光染料来检测细胞的不同组分，而且这些检测可以同时进行。

共聚焦显微镜技术

共聚焦显微镜使用汇聚的光束或者激光成像，而不是对样品进行宽场光成像。共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）使用一束的聚焦的单激光束，以及一个成像针孔和检测器 。转盘共聚焦显微镜则使用多束激光以及一系列基于尼普科夫转盘原理移动的针孔，这样做显著地相提高了成像的速度。共聚焦显微镜能实现光切片。这一过程使得系统能够获得一个样品内若干不同深度的焦点图像，然后通过点对点配准方式将这些图像重建成一个样品的3D图像。共聚焦图像是通过空间滤波来消除厚样品中非焦平面的光的。CLSM 和转盘共聚焦显微镜传具备统光学显微镜所没有的一些优势。这两项技术的空间分辨能力以及对更厚样品成像的能力都有很大提升，并能更加有效的降低背景噪声。它们也能够控制成像的深度，并对厚样品进行光学切片。多光子显微镜（Multiphoton microscopy，MPM）是一类非线性激发能量在一个薄平面激发荧光的激光扫描显微镜，它能够改善3D成像的质量。MPM的成像深度可以达到几百个微米，对于厚切片、组织以及活动物成像非常有价值。

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