脱离套路求创新！！5+细胞焦亡! 生信小白毕业不愁啦！！

小记者今天沉浸在PubMed知识的海洋时，发现了在常规套路上进行创新的文章，常规套路，极易复现，外加创新点，轻松拿到5+的分数，具体它是怎么做到的，听小记者细细讲来~ ~

小记者细细品读这篇文章之后，发现这篇文章极其适合生信小白，细胞焦亡作为细胞程序性死亡的一种，是近两年的生信分析热点，抓住细胞焦亡这个创新点，加上清晰的分析思路，整篇文章虽然简单但逻辑性比较强，加上调控轴的精准预测（ps：将LncRNA和miRNA以及mRNA联系起来，为后续的机制研究大侠了基础），整个文章创新性就更高了，7分+简直手到擒来！

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PAAD是恶性消化道肿瘤之一，肿瘤切除率低、转移率和复发率高，对放化疗尤其不敏感。尽管已经研究了许多与PAAD相关的预测性生物标志物，但它们不能完全满足个体化治疗和生存预测的要求。因此，需要新的预后模型和预测标志物来提高PAAD患者的生存率。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种程序性细胞死亡，最近的研究表明，细胞焦亡可能参与肿瘤发生和免疫微环境的调节。然而，焦亡相关基因（PRGs）在胰腺腺癌（PAAD）中的作用尚不清楚。

从Genecards数据库（https://www.genec ards.org/）总共获得了33个PRGs，对其进行差异分析和功能富集分析，其次利用STRING数据库（https://string-db.org/）构建PRG的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。采用单因素Cox、多变量Cox回归分析构建PAAD的预后模型，其次通过Kaplan-Meier分析、构建列线图来评估模型的预后，进一步分析预后与免疫浸润和肿瘤突变负荷之间的相关性。使用TarBase V.8数据库和starBase数据库确定LncRNA-miRNA-mRNA调控轴，最后实验验证CASP6在PANC-1细胞中的作用。

使用TCGA和GTEx数据集鉴定了PAAD和正常组织中的33个PRGs，其中31个基因上调，而其他两个基因（GSDME和PJVK）未检测到（图 1A）。基于STRING数据库，PPI网络表明AIM2、PYCARD、CASP1、CASP5、CASP8、GSDMD、NLRC4、NLRP1和NLRP3是枢纽基因（图1B），相关分析以确定这些基因之间的相互作用关系（图1C）。

图1 PAAD中PRGs表达的鉴定

使用Metascape进行GO和KEGG分析。GO分子功能分析显示，33个PRGs主要与细胞凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性、蛋白结构域特异性结合、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸结合、细胞因子受体结合以及半胱天冬酶激活和募集结构域结合相关。GO生物学过程分析表明，33个PRGs主要参与焦亡、对细菌的反应、白细胞介素1β产生的正向调节、对脂多糖的反应和凋亡信号通路。在GO细胞成分分析中还发现这33个PRGs主要涉及炎性复合体、细胞体、吞噬囊泡和分泌颗粒腔。KEGG通路分析显示，33个PRGs与NOD样受体信号通路、沙门氏菌感染、结核病、细胞凋亡和中性粒细胞胞外陷阱形成相关（表 1）。

表1. GO和KEGG分析

采用单因素Cox回归分析评估PAAD患者的预后。鉴定出10个具有临床预后价值的基因：AIM2、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP8、GSDMC、IL18、NLRP2和PYCARD（图 1D）。Kaplan-Meier曲线表明上述10个基因表达低的PAAD患者生存时间更长（图2A-J）。基于上述预后基因，使用LASSO Cox回归建立了一种新的预后模型（图3 A，3B）。较高的风险评分与死亡风险增加有关，低风险组的PAAD患者比高危组的患者预后更好（图3C，3D）。此外，我们使用ROC曲线进一步研究了生存概率，表明曲线下面积在1年时为0.689（95%CI 0.609-0.770），在3年时为0.794（95%CI 0.707-0.881），在5年时为0.814（95%CI 0.679-0.956）（图3E）。

图2 10个PRGs的生存分析曲线

图3  PAAD中新预后模型的构建

结合PRGs和临床病理特征，构建列线图来预测生存概率。单因素和多因素回归分析显示CASP8、GSDMC、年龄、新发肿瘤类型是影响PAAD患者预后的独立因素（图4 A，4B）。根据 CASP3、CASP5、CASP8、GSDMC、年龄和肿瘤状态构建临床预测列线图，列线图表明 1 年、3 年和 5 年生存概率表现出较好的预测能力。此外，校准曲线与列线图显示出良好的一致性（图4 C、4D）。

ps：列线图构建和校准曲线分析一般是捆绑的，

也是近期细胞死亡套路中常见的分析方法，

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图4 构建列线图及校准曲线

TMB是癌症预测的生物标志物，10个PRGs基因与除CASP6以外的各种免疫抑制剂和激活因子呈正相关（图5A）。在PAAD中，TMB与CASP3、CASP5 、CASP6、CASP8、IL18、和 PYCARD基因正相关（图5C，5E-5G，5I，5K），而与AIM2、CASP4、GSDMC 和NLRP2基因没有显著关系（图5B，5D，5H，5J）。这些结果表明，PRGs与肿瘤免疫浸润之间存在显著相关性。

图5 PAAD中PRG的免疫检查点和TMB分析

CASP4、CASP6、CASP8、IL18和PYCARD基因与临床分期密切相关（图6A）。基于上述5个基因，使用TarBase V.8数据库预测上游miRNA，获得94个mRNA-miRNA对。并使用starBase数据库进一步评估PAAD中预测的miRNA的表达和预后，发现只有hsa-miR16-5p（CASP6和CASP8的上游miRNA）（图6B，P < 0.001）和hsa-miR-26a- 5p（PYCARD 的上游 miRNA）（图6C，P = 0.025）与 PAAD 患者较差OS相关（图6B，P = 0.041，图6C，P = 0.025）。最后，使用GEPIA和starBase数据库分析上述 lncRNA在PAAD中的表达和预后，结果显示，仅PVT1（hsamiR-16-5p的上游lncRNA）上调（图6D，P < 0.05）并且在PAAD患者中预后较差（P = 0.041）。因此，lncRNA PVT1/hsa-miR-16-5p/CASP6/CASP8调控轴可能是PAAD进展中的关键ceRNA网络（图6E）。

ps：将lncRNA-miRNA-mRNA联系起来！

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图6 构建CeRNA (LncRNA-miRNA-mRNA) 调控轴

该研究以细胞焦亡为研究对象，将PRGs与临床关联起来，构建了PAAD的预后模型，首次在PAAD进展中发现了关键的ceRNA调控轴lncRNA PVT1 / hsa-miR-16-5p / CASP6 / CASP8，为后续的机制研究打下了基础。“首次发现”就不意外该文章能发到7分+了！伙伴们，码住这个思路行动起来吧！