入门小白看过来！！小众肿瘤联合代谢，干湿结合发2区5分+不要太简单！进来瞧瞧！

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这篇文章选取了不太常见的多发性骨髓瘤，结合代谢相关基因，从公共数据库中获取了多组数据集和基因列表，并对患者进行分型，采用机器学习构建预后模型。最后通过实验（qRT-PCR、Transwell等）验证了预后基因的表达。文章使用了多种数据库和分析工具，整体分析思路简单，逻辑清晰，湿实验验证也较为容易，朴实无华也能拿下2区5分+！！入门级小白们看着还不心动吗，不如大胆一试 ~~

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约10%的血液系统恶性肿瘤为多发性骨髓瘤（MM），这是一种无法治疗的癌症。虽然乳酸和支链氨基酸（BCAA）参与支持各种肿瘤的生长，但它们对多发性骨髓瘤的预后是否有影响尚不清楚。 

从基因表达总库（GEO）数据库和癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取 MM 相关数据集（GSE4581、GSE136337和TCGA-MM）。在GSE4281数据集中，通过R软件包“ConsensusClusterPlus”分别获得了乳酸和BCAA代谢相关亚型。R软件包“limma”和Venn图都被用来识别乳酸-BCAA代谢相关基因。随后，通过单变量 Cox、最小绝对收缩和选择操作器（LASSO）以及多变量Cox回归分析，构建了MM患者乳酸-BCAA代谢相关预后风险模型。应用基因组富集分析（GSEA）和R软件包“clusterProfiler”探索两组间的生物学变异。此外，还应用了单样本基因组富集分析（ssGSEA）、微环境细胞计数器（MCPcounte）和xCell技术来评估MM的肿瘤微环境（TME）评分。使用“oncoPredict”软件包计算了治疗MM的药物IC50值，并通过分子对接进行了进一步的药物鉴定。最后对预后基因进行实验验证表达。 

根据27个BCAA代谢相关基因（群1=159，群2=97）或13个LMRG（群1=143，群2=113）的表达模式，将256例MM患者聚类为两个分子亚型（k=2）（图1A和E）。不同亚型中BCAA代谢相关基因和LMRG的表达情况分别见图1B和图F。PCA结果显示了这些聚类结果的合理性，表现出良好的内部一致性和稳定性（图1C和G）。在BCCA代谢相关亚型和乳酸代谢相关亚型中，第1组的预后结果比第2组差（图1D和H）。 

图1 确定BCAA和LMRG代谢的不同亚型

在BCCA代谢相关亚型中，共筛选出1079个DEGs（718个基因上调，361个基因下调）（图2A）。根据BP分析，这些基因与MM中肽基酪氨酸磷酸化的控制和细胞-细胞粘附的控制有关。在CCs中，这些DEGs参与了基于肌动蛋白的细胞投射、膜筏和质膜外侧。在MF中，这些DEGs参与了特定的重要功能，例如C-C 趋化因子受体活性和细胞因子结合（图2B）。此外，KEGG通路富集结果显示，这些DEGs只与JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及细胞粘附分子有关（图2C）。在乳酸代谢相关亚型中，共筛选出699个DEGs（294个基因表达增加，405个基因表达减少）（图2D）。BP分析显示，这些DEGs与免疫反应相关的中性粒细胞脱颗粒和活化有关。就CCs而言，这些DEGs也参与了膜筏的活动。关于中性粒细胞，这些DEGs只参与翻译起始因子的活动（图2E）。特别是，根据KEGG通路富集研究，这些基因与癌症中的中心碳代谢和翻译起始因子活性有关（图2F）。 

图2 BCAA和LMRG相关亚型的差异表达分析

通过维恩图（图3A）得到了244个交叉基因，其中只有两个基因（CKS2和LYZ）与MM的预后相关，并通过单变量Cox回归分析被选为预后基因（图3B）。Lasso回归是一种统计方法，它可以避免多重共线性和多重回归模型的过度拟合，从而获得更精细的模型。当lamda.min=0.00874 时，这两个预后基因的回归系数不为0（图3C）。为了进一步筛选出最有预后价值的基因，进行了多因素Cox回归来研究它们的影响，结果仍然选择了CKS2和LYZ作为特征基因来构建MM患者的预后风险模型（图3D）。风险评分=0.2214×CKS2-0.1970×LYZ。根据中位风险=0.5591（图3E），MM患者被分为高风险组和低风险组。K-M曲线的结果显示，风险越低的预后越好（图3F）。ROC曲线显示，该风险评分特征在1年、3年和5年的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.655、0.640和0.701（图3G），表明该预后风险模型性能适中（图3G）。

图3 分析和评估与MM相关的

BCAA和LMRG的预后基因特征

随后对预后风险模型进行评估，发现数据集中Subgrp7（MM的7种分子分型）、AMPIND（荧光原位杂交检测FISH 1q21染色体扩增指标）和OS有显著差异（图4A）。TCGA数据集中的OS和iss（国际分期系统）存在差异（图4B）。GSE136337中del(1q)细胞（1号染色体长臂缺失）、del(13q)细胞（13号染色体长臂缺失）和iss存在显著差异（图4C）。在训练集和TCGA-MM数据集中，Subgrp7-CD1存在生存差异，而在GSE136337中，OS、iss1、性别、del(17p)细胞（17号染色体短臂缺失）和del(16q)临床FISH（16号染色体长臂缺失）存在差异（图 S3）。在训练集和GSE136337数据集中，风险评分和AMPIND是独立的预测指标（图5A和B）。根据独立的预后因素构建了列线图，以评估与风险评分和 AMPIND相关的1年、3年和5年OS（图5C）。校准曲线的斜率趋近于1，证明列线图的值是MM预后的良好预测工具（图5D）。同样，验证集GSE136337中的风险评分、del(17p)细胞、iss1和del(13q)细胞都是MM的独立预后因素（图5E、F），而验证集中的列线图仍然具有良好的性能（图5G、H）。这表明了MM风险评分的重要性。

图4 预后风险特征评估

图5 风险评分是一个独立的预后指标

在产生了两个风险组后，还对组间的DEGs进行了差异表达分析，共得到559个|log2FC|>0.5, P.Value < 0.05的DEGs（202个DEGs上调，357个DEGs下调）（图6A和B）。白细胞增殖和中性粒细胞脱颗粒是这些DEGs中富集的主要生物过程（图6C）。病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体通路的相互作用可能与MM有关（图6D）。GSEA结果表明，高风险组的DEGs主要富集在编码E2F转录因子细胞周期相关靶标的基因中，而E2F转录因子是受MYC调控的基因亚群（图6E）。而KRAS激活、血管生成和编码补体系统成分的基因是低风险组DEGs富集的三个主要机制（图6F）。 

图6 高风险组和低风险组的差异表达分析

3种算法的分析揭示了训练集中MM样本中各种免疫细胞浸润的丰度，结果显示只有ssGSEA中的17型T辅助细胞在高风险组和低风险组中没有显著差异，而其他免疫浸润细胞、免疫评分和基质评分随着评分的增加而增强了免疫相关特征（图7A和B）。不仅如此，免疫调节剂在高风险组和低风险组都有明显的表达差异（图7C和D）。其中，PDCD1LG2、KIR2DL1和ICOS在高风险组的表达水平较低。

图7 高风险组和低风险组的

免疫浸润和免疫调节剂表达分析

使用“oncoPredict”R程序，利用GDSC数据库计算两组MM患者的IC50。结果显示，168种药物的IC50在两组中存在显著差异。高风险组的IC50更低，这表明高风险患者更适合药物治疗。利用AutoDock探索了药物敏感性最高的前3种药物（卡莫司汀_1807、奈拉拉滨_1814和替莫唑胺_1375）与编码CKS2和LYZ蛋白的分子对接情况（图8A、B、C）。特征基因与三种药物的对接分数小于-1.2 k/mol，表明三种药物可以与特征基因完美地相互作用，从而影响MM的发生发展。例如，CKS2与Carmustine_1807、Nelarabine_1814和Temozolomide_1375分别通过3个、5个和3个氢键相互作用，对接分数分别为-5.71、-7.88和-5.73 kcal/mol。

图8 MM相关药物预测分析

利用肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）数据库，并采用统一表层逼近和投影法（UMAP）检测了骨髓瘤组织单细胞中CKS2和LYZ的表达水平（图9A）。从GEO数据集中获得了MM样本和正常组织样本的数据，目的是将CKS2和LYZ用于微阵列分析。结果显示，CKS2在MM样本中高表达（图9B）。在检测了CKS2和LYZ的表达后，发现CKS2在MM中的表达远高于正常骨髓液，而LYZ则恰恰相反（图9C）。为了验证CKS2的致癌和侵袭能力，利用MM1.S细胞生成了稳定沉默的CKS2细胞系，并评估了它们的存活率。沉默 CKS2 可促进细胞凋亡（图9E），抑制 A172 细胞的增殖、迁移和侵袭（图9D、F）。这一结果表明，CKS2可作为MM预后和治疗的特征基因。 

图9 验证2个基因特征的表达

在这项研究中，作者确定了与支链氨基酸和乳酸代谢相关的基因作为潜在的预后生物标志物，并开发了一种新的风险特征，可能为MM治疗和预后提供新思路。文章在公共数据库中获取了多个数据集和相关特征基因列表，将代谢相关基因与多发性骨髓瘤结合，采用机器学习构建预后模型，并通过实验验证了预后基因的表达。全文分析方法简单，思路清晰，又有湿实验验证，好一篇入门级学习范文。发到2区5.8分简简单单！！新手小白们不妨跟着学起来哦！