中山一院邹昌业团队立足中医药，中药单体网络药理学+单细胞占位5分+肿瘤生信！

要是说起发文章，学医的小伙伴们首先羡慕的应该就是临床方向的，毕竟众所周知各个临床数据库都摆在那里呢，只要肯挖掘甚至不做实验纯分析都能发高分，相比之下中医药方向的可能就没那么容易了。但中医药的朋友也不必气馁，小记者这就给大家支个招--利用网络药理学分析来发文。

要问小记者为啥支这个招，那必然是网络药理学和发文大咖--生信有着千丝万缕的关系，而网络药理学不仅取其精华可以助力中医药的朋友省时省力省钱的出结果，更是在创新这一块积极进取，简直就是为中医药朋友量身定制的发文利器！

那网络药理学是怎么帮中医药朋友快速发文的？快快快，让小记者拿一篇3天前才发的利用网药分析轻松拿下5分+的宝藏文章来一探究竟。作者首先从公共数据库中收集了药物与疾病的相关靶标，并通过PPI网络来鉴定核心靶标，利用scRNA-seq分析确定核心靶蛋白在疾病组织中的表达分布，然后对关键靶蛋白和活性成分之间进行分子对接，最后进行了体内和体外的实验验证。看到这里小伙伴应该发现，除了网药分析，作者还利用了干湿结合，更是将单细胞分析、分子对接等创新亮点加入其中，这些加分项组合在一起，高分文章还不是手到擒来的事！

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是儿童常见的实体恶性肿瘤，目前的药物治疗效果并不理想，因此迫切需要开发新的有效的OS治疗药物，木犀草素是许多中药中的活性成分之一，多项研究表明木犀草素可以诱导OS细胞凋亡，并减弱OS细胞的化疗耐药。但木犀草素治疗OS的作用机制尚不清楚，因此本研究利用网络药理学和分子对接技术，系统的评价木犀草素治疗OS的机制。 

作者首先从公共数据库中收集了木犀草素与OS的相关靶标,利用STRING构建了PPI网络来鉴定核心靶标。并对OS相关靶标和木犀草素对OS靶标的GO和KEGG富集进行了研究。而后通过scRNA-seq分析确定核心靶蛋白在OS组织中的表达分布。接下来通过分子对接、细胞生物学实验和OS原位小鼠模型验证木犀草素对OS增殖转移的抑制作用及机制。 

为了寻找潜在的新的OS治疗靶点，作者在GeneCards、TTD、OMIM和DisGeNET数据库的帮助下收集了3579个OS相关靶点(图1A)。作者进行了GO和KEGG通路富集分析以揭示潜在的治疗途径（图1B,C），结果显示，“骨化”、“DNA结合转录因子结合”和“细胞-底物连接”分别是生物过程、分子功能和细胞成分中最显著富集的条目。如图1C所示，“PI3KAkt信号通路”包含的靶标数量最多(213个)。 

图1 识别OS相关的靶点和通路 

为了寻找木犀草素在OS细胞中的靶点，作者从PharmMapper、CTD和Swiss Target Prediction中鉴定出全部402个木犀草素靶点，如图2A所示，并筛选出251个交叉靶点用于后续研究(图2B)。为了阐明木犀草素在OS细胞中的潜在生物学功能和KEGG通路，利用clusterProfiler R软件包对251个交叉靶点进行分析。图2C显示了10个显著富集的BP和KEGG通路条目。这些富集分析揭示了木犀草素对OS细胞发挥作用的潜在治疗途径，其中“细胞对化学应激的反应”和“PI3K-Akt信号通路”分别是最重要的途径。 

图2 木犀草素相关靶点和潜在治疗途径的鉴定 

为了阐明木犀草素通过多种途径和靶点治疗OS的机制，图3利用Cytoscape可视化了木犀草素-靶点-通路网络，包括145个节点(128个靶点和16条通路)和922条边。这些信号通路和靶点可能是木犀草素治疗OS的关键机制，包括IL-17-、PI3K-Akt-、TNF-等信号通路。 

图3 木犀草素-靶点-通路网络 

为了进一步分析木草素在OS中的核心靶点，作者分别使用STRING数据库和Cytoscape软件对PPI网络进行分析和可视化(图4A)。通过CytoHubba分析鉴定出八个核心靶点，包括AKT1、ALB、CASP3、JUN、STAT3、IL6、VEGFA和TNF(图4B)。MCODE分析显示两个显著模块得分分别为54.674(聚类1)和11.389(聚类2)。这些模块包括8个Hub 靶点，如图4C所示。 

图4木犀草素核心靶点的PPI网络 

木犀草素在治疗OS中的复杂相互作用的细节可以使用综合通路图来显示。OS中三个最主要的木犀草素相关信号通路包括hsa04151-PI3KAkt信号通路、hsa04657-IL-17信号通路和hsa04668-TNF信号通路。如图5所示，AKT、CASP、IL6、JUN、TNF和STAT3等多个Hub靶点在这些信号通路中发挥重要作用。 

图5 木犀草素的综合通路图 

为了验证这些Hub靶点在骨肉瘤中的临床价值，作者比较了正常骨和骨肉瘤组织中Hub靶点的表达水平。如图6A所示，骨组织中IL6、TNF、STAT3、VEGFA、AKT1和JUN的表达明显高于正常骨。使用TARGET数据库分析Hub靶点对总生存和转移的诊断价值。如图6B所示，AKT1对总生存的诊断价值较差，曲线下相应面积小于0.5。随着时间的推移，IL6、JUN、STAT3和VEGFA对总生存率的诊断价值也在增加。如图6C所示，CASP3和VEGFA对转移的诊断价值随着时间的推移而增加。 

图6 Hub靶蛋白在OS中的表达水平及诊断价值 

基于PPI网络分析，选择8个Hub靶点与木犀草素进行分子对接。木犀草素与这些Hub靶点的对接结合能和如图7所示。

图7 木犀草素与Hub靶点的分子对接结果 

为了进一步了解核心靶点在不同OS细胞类型中的表达水平差异，作者鉴定了OS组织的细胞类型，并通过单细胞测序分析检测了核心靶点的表达。如图8A-B所示，作者以0.3的分辨率获得了21个簇，并根据标记基因表达和之前的研究将13种不同的细胞类型分类，包括成软骨OS细胞、破骨OS细胞、周细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、间充质干细胞、成肌细胞、成纤维细胞，成骨OS细胞，以及特殊的成骨细胞类型，如增殖成骨OS细胞，MYC+成骨OS细胞。AKT1在成肌细胞和MYC+成骨OS细胞中高表达，而VEGFA和STAT3在成软骨OS细胞和MYC+成骨OS细胞中高表达。JUN在每种细胞类型中广泛表达(图8C)。此外，AKT1在原代样品的MYC+成骨OS细胞和转移样品的成肌细胞中的表达均显著升高，转移样本的成纤维细胞中同时表达AKT1、STAT3和VEGFA(图8D)。 

图8核心靶标在不同的OS细胞类型中表达

为了验证MCODE和CytoHubba分析预测的木草素对OS的影响，作者使用143B和SJSA1细胞系进行了一系列细胞生物学实验。如图9A-B所示，木犀草素对OS细胞的抑制作用呈浓度依赖性，其对143B和SJSA1细胞株的IC50值分别为34.45 μM和82.55 μM。此外，通过transwell实验发现木犀草素还能抑制两种细胞系的侵袭能力(图9C)。然后通过western blot检测Hub靶点的蛋白表达(图9D)。木犀草素作用48 h后，两种细胞系中AKT1、STAT3和IL6的表达均呈浓度依赖性降低，TNF和VEGFA仅在160 μM孵育后降低。与对照组相比，木犀草素诱导了cleaved-CASP3的表达。在这些细胞系中未检测到ALB的表达。 

图9 木犀草素通过改变中枢靶点的表达抑制

OS细胞的活力和侵袭能力

为了验证网络药理学和细胞实验的结果，作者构建了143B-Luc细胞系，并将其注射到小鼠胫骨髓质中，建立OS原位小鼠模型。然后在小鼠腹腔注射木犀草素，用IVIS监测肿瘤大小和转移情况。如图10A和B所示，木犀草素在OS原发部位表现出明显的抗肿瘤作用，两组体重相近。切除的肿瘤证实了上述结果(图10C)。此外，木犀草素还可以抑制OS肺转移，通过发光和H&E染色图像证实(图10D, E)， H&E染色显示两组间无明显组织学差异，证实木犀草素无肝毒性和体内安全性(图10E)。

图10 木犀草素抑制原位OS模型的增殖和转移

文章针对木犀草素和OS进行了网络药理学分析，不仅结合了分子对接、单细胞测序等创新亮点，更是进行了体内外的实验对分析结果进行验证，进而使文章整体详实而有说服力，其思路复现起来也是杠杠容易，所以对网药分析感兴趣的小伙伴们还在等什么，码住思路，朝着高分文章冲就完了！复现后设计思路、定制生信分析记得扫码找小记者哟~